肝螺杆菌甲基基团接受趋化信号转导蛋白的克隆表达及纯化

目的克隆肝螺杆菌(H.hepaticus)甲基基团接受趋化信号转导蛋白(MCP)基因,制备MCP重组蛋白,为以后检测我国人群肝螺杆菌感染率提供实验基础。方法利用PCR方法扩增目的基因片段,连接至原核表达载体pET22b(+),构建MCP的原核表达质粒pET22b+/MCP。将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组蛋白。结果构建了原核表达质粒pET22b+/MCP,含有该质粒的大肠杆菌经1 mmol/L IPTG诱导4 h后表达一相对分子质量约14 kD的重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析系统纯化获得了MCP的纯化重组蛋白rhMCP。结论获得了肝螺杆菌MCP的纯化重组蛋白,为进一步利用血清学方法调查我国人群肝螺杆菌感染率提供可能。

肝螺杆菌甲基基团趋化信号转导蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肝螺杆菌甲基基团趋化信号转导蛋白多克隆抗体。方法将我室保种的重组质粒pET22b+/MCP转化大肠杆菌感受态BL21(DE3),IPTG诱导表达His-rhMCP融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化后,免疫家兔制备抗体,间接ELISA法测定抗体效价,以制备的菌体外膜蛋白(肝螺杆菌、胆型螺杆菌及幽门螺杆菌)采用Western blot鉴定抗体的特异性。结果大肠杆菌成功表达His-rhMCP融合蛋白,ELISA法检测抗体的效价达到1∶32000,Western blot检测结果显示抗体可与肝螺杆菌菌体外膜蛋白及His-rhMCP特异结合。结论制备了高效价、高特异性的rhMCP抗体,为进一步研究肝螺杆菌的流行病学奠定了基础。

空肠弯曲菌mcp1／2／3基因原核表达及其产物与细菌趋化作用的相关性

目的克隆空肠弯曲菌（Campy1obacter jejuni）接受甲基趋化蛋白（MCP）编码基因mcp1、mcp2和mcp3并构建其原核表达系统，建立空肠弯曲菌体外趋化模型并确定趋化诱导物质，了解MCPs与趋化诱导物之间的关系。方法PCR扩增mcp1、mcp2和mcp3基因片段，T-A克隆后测序。构建上述目的基因原核表达系统，SDS—PAGE和Bio-Rad凝胶成像分析系统检查目的重组蛋白rMCP1、rMCP2和rMCP3的表达情况，Ni—NTA亲和层析法提纯rMCPs。rMCPs免疫家兔获得抗血清，免疫扩散法测其效价。用饱和硫酸铵盐析法和DEAE-32离子交换法提纯IgG，经胃蛋白酶酶解和Sephadex G-100层析制备IgG F（ab′）2。建立HAP（hard—agar plus）法空肠弯曲菌体外趋化模型并检测8种物质的趋化诱导作用。采用基于IgG F（ab′）2封闭的趋化阻断试验，确定不同MCPs的功能及其差异。结果PCR扩增获得预期大小的mcp1、mcp2和mcp3基因片段，其核苷酸和氨基酸序列与文献报道完全相同。所构建的原核表达系统能有效地表达各rMCPs，其产量均约为细菌总蛋白的10％。rMCP1、rMCP2和rMCP3免疫家兔后能产生特异性抗体，其免疫扩散效价均为1：4。牛胆汁和脱氧胆酸钠（DOC）对空肠弯曲菌趋化有浓度依赖性诱导作用（P〈0．05）。MCP1和MCP2被其IgG F（ab′）2封闭后，空肠弯曲菌对DOC的趋化能力明显减弱（P〈0．05），MCP3被封闭后对空肠弯曲菌趋化能力无影响（P〉0．05）。结论本研究成功地表达了空肠弯曲菌MCPs蛋白。牛胆汁和DOC是诱导空肠弯曲菌趋化的信号物质，MCP1和MCP2可能参与该菌对DOC的趋化过程。