甲基对硫磷降解菌L1的分离、鉴定及降解酶基因的克隆

从农药厂的污水处理池中分离到一株能高效降解甲基对硫磷的菌株L1,L1能以甲基对硫磷为惟一碳源、氮源和能源生长;经生理生化实验和16s rRNA同源性分析,初步将L1归为节杆菌属(Arthrobacter sp.)。紫外分光光度法对L1的降解性能研究表明,L1能在12h内将50mg/L的甲基对硫磷完全降解;用PCR方法克隆其甲基对硫磷降解酶基因mpd,这是迄今首次从革兰氏阳性菌中克隆到的mpd基因。

甲基对硫磷高效降解菌的分离鉴定及降解酶基因的克隆表达

从湖北沙隆达农药厂污水处理池的活性污泥中分离到一株能以甲基对硫磷(MP)和对硝基苯酚(PNP)为唯一碳源生长的细菌HS-D36,经生理生化试验和16S rDNA同源性分析,初步鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri).该菌在3h内对浓度为50mg.L-1MP的降解率为90%;在12h内能将50mg.L-1PNP完全降解.HS-D36在以MP为唯一碳源的无机盐培养基上可以耐受800mg.L-1的MP,在LB培养基上可耐受浓度为2000mg.L-1的MP.同时,克隆了甲基对硫磷水解酶基因mpd,并在E.coli中获得高效表达.重组甲基对硫磷水解酶粗酶液活性达到52.5U.mL-1.

甲基对硫磷降解菌DLL-1的发光酶基因标记及在土壤中的变化

采用三亲接合法成功地将携带有发光酶基因的pTR1 0 2转入了甲基对硫磷降解菌Pseudomonassp .DLL -1菌株中。获得的接合子在液体培养、固体培养过程中以及在土壤中其标记质粒非常稳定。标记质粒并没有给受体细胞的生长、降解甲基对硫磷的能力带来严重的影响。因此 ,将标记菌株DLL -1-B用于土壤生态研究是可行的。在土壤中 ,DLL -1 -B的数量在接种后最初 2天下降幅度较小 ,随后下降速度较快 ,但当下降到 1 0 3～ 1 0 4 g- 1时趋于稳定。DLL -1 -B在水中下降速度更快 ,存活时间更短。DLL -1 -B在旱地土壤中的移动性较差 ,大多存在于 0～ 1 0cm土壤中。在水田中 ,DLL -1 -B的移动性较好 ,2周后 ,2 0～ 3 0cm土壤中测得DLL -1 -B为 2× 1 0 2 g- 1。

有机磷农药降解酶基因Oph2的克隆及甲基对硫磷降解效果研究

目的挖掘可高效表达有机磷农药降解酶的基因,并构建含有该表达基因的工程菌,提供一种高效降解甲基对硫磷的新方法。方法利用基因克隆获得高效表达有机磷农药降解酶基因Oph2,采用基因工程手段将其转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统,对毕赤酵母的发酵产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)定性和酶活定量研究,通过与目标底物甲基对硫磷反应,分析工程菌表达降解酶对甲基对硫磷的降解效果。结果本研究成功克隆得到了高效表达有机磷农药降解酶基因Oph2,基因全长1000 bp,编码256个氨基酸,酶蛋白分子量为37 kD,并利用表达载体pPIC9K成功将其转化至毕赤酵母GS115。构建的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2表达有机磷农药降解酶活性为11.57 U/mL,对6.8 mg/L的甲基对硫磷降解效率为90%以上。结论本研究得到的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2可高效表达有机磷农药降解酶,该酶活性高,对甲基对硫磷降解能力强,可有效应用于甲基对硫磷的降解。

耐盐及苯乙酸、甲基对硫磷降解基因工程菌的构建

H1 (Halomonassp.)是一株耐高盐浓度 (1 8%NaCl,W V)和降解苯乙酸的菌株 ,pDT3质粒为pUC1 9插入甲基对硫磷水解酶基因 (mpd基因 )构建而成。采用HindⅢ酶切 ,获得含有完整mpd基因片段 ,克隆到广宿主质粒pKT2 3 0和pBBR1 MCS2上 ,构建成质粒pKT MP和pBBR MP。通过三亲杂交 ,在辅助质粒pRK2 0 1 3的帮助下 ,将质粒pKT MP和pBBR MP转移到H1中 ,得到的工程菌H pKT MP和H pBBR MP具有耐盐、降解苯乙酸和水解甲基对硫磷的功能 ,其中H pBBR MP水解酶活性与亲本菌株甲基对硫磷降解菌 (Pseudomonasputida)DLL E4相当 ,而H pKT MP水解酶活性要提高 1倍左右。经过传代试验 。

遗传稳定型六六六、甲基对硫磷降解基因工程菌的构建及特性研究

通过转座子介导同源重组的方法,将甲基对硫磷水解酶基因mpd导入到六六六降解菌BHC-A的染色体上,构建了能同时降解六六六和甲基对硫磷的基因工程菌BHC-A-mpd.对其生长特性和降解特性的研究表明,工程菌在LB培养基中的生长特性与原始菌株没有差别,生长至对数期A600 nm值都可达到2.5;对六六六的降解特性和原始菌株相同,可在10 h内将5 mg/L的六六六完全降解.mpd基因在BHC-A-mpd中稳定表达,BHC-A-mpd可以降解多种有机磷类农药.该基因工程菌的构建为六六六和甲基对硫磷复合污染环境的生物修复奠定了基础.

趋化信号转导基因cheA突变对Pseudomonas putida DLL-1甲基对硫磷的趋化性及原位降解的影响

Pseudomonas putida DLL-1是一株甲基对硫磷（MP）高效降解菌株,同时对MP具有趋化性.cheA基因是菌株趋化信号转导过程中负责编码组氨酸激酶的基因,为了研究菌株趋化性在农药原位降解中的作用,通过基因打靶的方式使P.putida DLL-1染色体上单拷贝的cheA基因失活,成功地获得了MP的趋化突变株P.putida DAK,突变株与野生菌株生长能力没有显著差异.通过土壤盆钵试验（MP浓度为50mg/kg）,发现在灭菌与未灭菌土壤中趋化突变株对MP的降解能力低于原始出发菌株DLL-1约20%～30%,说明菌株DLL-1趋化性的丧失会减慢其对农药的降解,趋化性在农药的原位降解过程中发挥重要作用.

解毒酶降解甲基对硫磷的研究

为验证产碱假单胞菌代谢产生的解毒酶对农药的降解作用,研究了该酶对水体系和蔬菜中的甲基对硫磷的降解规律,同时采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析了酶作用后甲基对硫磷的降解产物。结果表明:此酶可以有效降解甲基对硫磷的残留,且酶浓度越高,其降解效果越好。当水体系中甲基对硫磷起始浓度为0.3 mg/L时,添加320 mg/L的酶作用90 min后,甲基对硫磷的降解效果可达81.7%;当蔬菜体系中甲基对硫磷浓度为0.5 mg/kg时,添加相同量的酶作用60 min后,甲基对硫磷的降解效果可达58.5%。通过GC-MS确定降解产物为4-硝基酚,水体系中甲基对硫磷的降解规律符合一级反应动力学模型(R2>0.84),这为促进其在实际生产中的应用提供理论依据。

Pseudomonas sp.1-7中甲基对硫磷水解酶基因的克隆及酶学性质研究

为了研究和分离有机磷降解酶及其编码基因,从农药厂污水处理池的活性污泥中分离出一株可以高效降解甲基对硫磷的细菌1-7,经16S rDNA鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.。通过构建基因组文库的方法克隆了1-7的甲基对硫磷水解酶基因ophc3,该基因全长为975 bp,编码324个氨基酸,其中前24个氨基酸残基可能为信号肽序列。将其在大肠杆菌中表达,并对重组甲基对硫磷水解酶(OPHC3)进行纯化和酶学性质的研究结果表明,其酶促反应最适pH值为8.0,在pH 6.0～10.0的范围内放置30 min酶的相对活性均在70%以上;最适反应温度为45℃,但该酶不耐高温,60℃下保温10 min,相对活性降至46.77%。

甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究

用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因 ,构建了重组表达质粒pET2 9a_mpd ,将其转化至EscherichiacoliBL2 1 (DE3)中 ,经IPTG诱导表达 ,得到C 末端含有 6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶 ,用Ni NTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫磷水解酶。测定了环境因素对酶活性的影响及酶动力学参数。甲基对硫磷水解酶水解甲基对硫磷时 ,最适pH8 6～ 8 8,最佳反应温度 1 5℃ ;Mn2 + 、Zn2 + 、Cu2 + 可使酶活性增加 1 5 %～ 2 0 % ,Ca2 + 、Mg2 + 微弱地促进酶的作用 ,Ni2 + 对酶活性几乎无影响 ;1mmol LEDTA·Na2 + 几乎不影响酶的活性 ,而 1 0mmol LEDTA·Na2 + 对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用。甲基对硫磷水解酶水解乙基对硫磷时 ,最适pH8 6。 2 5℃时 ,该酶对甲基对硫磷的米氏常数Km 为 (6 8 6± 5 1 ) μmol L ,kcat为 (4 5± 6 )S- 1 ;对乙基对硫磷的米氏常数Km 为 (5 9 5± 6 0 )μmol L ,kcat为 (8± 1 )S- 1 。kcat Km

甲基对硫磷水解酶酶促反应体系建立及特性研究

从甲基对硫磷降解菌DLL E4 (Pseudomonasputida)中提取水解酶 ,对其酶促反应进行研究 ,建立了反应体系 :4 74 μLNa2 HPO4 柠檬酸缓冲液 ,12 5 μL甲基对硫磷 ,1 5 μg粗蛋白 ,35℃水浴 5min。水解酶保持稳定的 pH值范围为 5 0～ 10 0 ,最适 pH为 7 0。该酶热不稳定 ,4 5℃ 30min处理 ,酶活下降 5 0 % ;10 0℃ 10min处理可完全灭活。测定了 11种金属离子、TWEEN 80、TritonX 10 0及EDTA对水解酶的作用 ,发现 2 0mmol·L-1CoCl2 对酶活有明显的抑制作用 ,而 2 0～ 0 0 2mmol·L-1的LiCl对酶活有促进作用 ,2mmol·L-1的TWEEN 80和TritonX 10 0可降低 80 %的酶活。

拟南芥叶片衰老前后叶绿素降解代谢基因表达和酶积累的模式及其影响因素分析

由叶绿素降解引起的叶片衰老褪绿不仅是植物衰老最直观的性状,还是植物进行营养动员的关键事件。近年来,进入衰老窗口(senescence window)后的叶片中叶绿素降解代谢酶基因(Chl catabolic genes,CCGs)的表达调控已经得到了较为充分的研究,但在未衰老叶片中对CCGs表达模式的研究还鲜见报道。本研究中,我们分析了主要叶绿素降解代谢酶(Chl Catabolic Enzymes,CCEs)及其编码基因CCGs在自然衰老以及未衰老的拟南芥叶片中的表达模式。研究结果显示,在叶片自然衰老过程中,CCGs剧烈上调表达且CCEs蛋白逐渐累积,以催化衰老细胞中叶绿素的大量降解;值得注意的是,在长日照培养条件下,未衰老叶片中CCGs的表达存在显著的波动,其表达量在光照开启后开始上升,10:00~16:00之间达到峰值后逐渐下降。我们的分析显示,CCGs表达量的波动很有可能是光-暗交替导致的,与CCA1介导的节律信号没有明显的相关性。我们的研究结果提示,外界光信号对未衰老叶片中CCGs的表达调控起至关重要的作用。

一株有机磷农药降解菌的分离、鉴定及降解酶基因的克隆

从农药厂污水处理池中分离到一株能很好降解甲基对硫磷和对硝基苯酚的菌株Yw18,它能以甲基对硫磷或对硝基苯酚为惟一碳源生长,经鉴定,为苍白杆菌(Ochrobacterumsp.)。用气相色谱法和分光光度法对Yw18的降解性能进行了研究,结果表明,在0.5 h内它对50 mg.L-1甲基对硫磷的降解率达90%以上,在8 h内能将50 mg.L-1对硝基苯酚完全降解。对该菌进行了系统发育研究,并用PCR法克隆其甲基对硫磷降解酶基因mpd。

有机磷农药降解酶及其基因工程研究进展

有机磷农药是国内外使用最广泛的农药之一 ,为农业丰收做出了很大贡献。但是 ,有机磷农药具有抑制人体乙酰胆碱酯酶的功能 ,对人存在着程度不同的毒性。有机磷农药降解酶可降解有机磷农药分子 ,破坏有机磷农药的磷酯键而使其脱毒。综述了有机磷农药降解酶及其特性 ,以及相关基因的分离克隆和基因工程研究进展。

高温纤维素降解菌的筛选及内切酶基因的克隆表达

以滤纸条作为唯一碳源从以牛粪和砻糠为原料的堆肥样品中分离到了8株具有纤维素降解特性的微生物,其中菌株T1和T2在刚果红培养基上培养48 h后的水解圈明显大于其他菌株。对菌株T1和T2进行了生理生化和16S rRNA序列分析,克隆了菌株T2的内切酶基因并对该基因进行了结构域分析,同时构建了表达载体p28-egB并将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。研究结果表明:(1)菌株T1和T2可分别鉴定为Bacillus cereus和Bacillus subtilis;(2)菌株T2的内切酶基因片段大小为1500 bp,编码499个氨基酸,结构域分析显示该酶由两个不连续的结构域组成,其一为N端催化结构域,由糖基水解酶家族5组成,其二为C端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成;(3)在E.coli BL21中成功表达了菌株T2的内切酶基因,SDS-PAGE电泳图谱显示该蛋白大小约为50 KD,浓度约为93.14 mg·L-1。

翻白草对2型糖尿病大鼠胰岛素降解酶基因表达的影响

目的 研究翻白草水煎剂对2型糖尿病大鼠胰岛素降解酶基因mRNA表达的影响。方法 随机选取以不同剂量的翻白草水煎剂灌胃的2型糖尿病大鼠、以安慰剂灌胃的2型糖尿病大鼠以及正常对照各10只,用RT-PCR法测定肝细胞胰岛素降解酶基因mRNA的表达。结果 服用翻白草后,2型糖尿病大鼠的胰岛素降解酶基因mRNA的表达下降,而服用安慰剂的糖尿病大鼠上述指标无显著变化。结论 翻白草能降低2型糖尿病大鼠胰岛素降解酶基因的表达。

‘砂糖橘’夏梢生长对幼果和离区细胞壁降解酶活性及基因表达的影响

以10年生‘砂糖橘’(Citrus reticulata Blanco)为对象,研究夏梢生长对幼果及果柄离区的细胞壁降解酶活性、相关基因表达及其脱落的影响。结果表明:夏梢萌发6 d后幼果大量脱落,15 d后累积落果率高达79.5%,比同期去梢的增加91.7%。夏梢生长明显促进幼果和离区中纤维素酶(Cx)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的提高,其活性水平与相对落果率均达显著正相关。果胶(甲)酯酶(PME)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性不受夏梢生长所影响。基因表达结果显示,夏梢生长促进CsPG、Csβ-Gal和Cs Cx的表达上调,6 d时出现表达峰值,而CsPME的表达不受夏梢影响。综合认为‘砂糖橘’夏梢生长诱导幼果脱离过程中,Cx、PG是参与脱落调控的细胞壁降解关键酶。

克雷伯氏菌ZD112氯氰菊酯降解酶基因的克隆与生物信息学分析

目的筛选新的菊酯农药降解酶基因并了解其特性,为解决食品和环境中的菊酯农药残留问题创造条件。方法通过构建基因文库的方式筛选获得新的菊酯农药降解酶(EstP)基因,并对其进行一系列生物信息学分析。结果获得了新的菊酯农药降解酶(EstP)基因。EstP属于水解酶类,由638个氨基酸编码,预测分子量为73.4 kDa,pI值为8.34,与其他蛋白相似性极低,不属于任何已知的蛋白超家族,仅与羧肽酶Taq(M32)的保守域具有一定相似性,推测Lys137,Glu116,Glu148为其必需氨基酸。结论新的菊酯农药降解基因得到克隆,生物信息学分析为其定向进化提供了理论指导,为高效基因工程菌的构建打下了基础。

高等植物中蔗糖降解酶及其基因表达与调控

大多数植物的库器官都是以蔗糖的形式接受碳源和能源,蔗糖进入库代谢需要转化酶和蔗糖合成酶降解成为葡萄糖和果糖,而糖又调节植物代谢过程中许多酶的基因表达,因此蔗糖降解酶是植物生长发育中起关键作用的酶.综述了近年来蔗糖合成酶和转化酶的作用及它们基因表达和调节的研究进展.

转锰过氧化物酶基因酵母的建立及其降解秸秆木质素能力的研究

为了提高锰过氧化物酶基因的表达产量,从黄孢原毛平革菌中获取锰过氧化物酶基因,并将其转化至毕赤酵母中。在液态发酵培养条件下,重组酵母与原始黄孢原毛平革菌所分泌的锰过氧化物酶活性分别为0.317 8U·m L^(-1)和0.197 2 U·m L^(-1)(P<0.05);重组酵母所表达酶的最适温度和p H值分别为40℃和4.5,与原始酶的生化特性基本一致。在含有玉米秸秆的液体培养基中,重组酵母对秸秆中木质素降解率达到24.09%,而黄孢原毛平革菌对木质素的降解率为16.53%(P<0.05)。