辐射扩散法测定脱氧核糖核酸酶活力

脱氧核糖核酸酶的活力测定,常用紫外吸收法、二苯胺试剂法、甲基绿结合法等。 Horney D.L和Webster D。A报导的辐射扩散法,利用色埋有甲基绿-DNA的琼脂糖凝胶作为底物,DNase浓度的对数与络合物脱色斑点的半径成正比例,可测定ng量(10-9克)的酶,样品只需μ1量体积,是一种非常灵敏的方法。本文参照有关文献,报导应用于测定牛胰DNase I冻干粉的初步结果。

基于成簇的规律性间隔的短回文重复序列关联的失活核酸酶9-脱氧核糖核酸甲基转移酶3A基因复合体的O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因启动子区甲基化修饰对胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性影响

目的探讨成簇的规律性间隔的短回文重复序列关联的失活核酸酶9-脱氧核糖核酸甲基转移酶3A基因复合体(CRISPR-dcas9-DNMT3A)介导的O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因(MGMT)基因启动子区域DNA甲基化修饰对胶质瘤细胞替莫唑胺(TMZ)耐药性的影响。方法 CRISPR-dcas9-DNMT3A表达载体通过慢病毒包装感染TMZ耐药细胞系U251-R[U251(中国医学科院基础医学研究所)通过替莫唑胺高浓度反复间歇诱导法诱导产生], 验证其对MGMT启动子区域DNA甲基化程度, MGMT表达水平以及TMZ药物敏感性影响。结果慢病毒感染成功的U251-R细胞, MGMT启动子区域甲基化水平增高[44.7%(17/38)、63.2%(24/38)、77.1%(27/38)比7.9%(3/38), P<0.05], MGMT蛋白表达减少, 细胞对TMZ化疗的敏感性增加(P<0.05)。结论 CRISPR-dcas9-DNMT3A慢病毒感染的U251-R细胞可通过增加其MGMT基因启动子区域甲基化水平减少MGMT蛋白表达从而增加化疗敏感性。

5-羟甲基胞嘧啶及其TET氧合酶在神经系统发育和相关疾病中的研究进展

神经系统的正常发育是多种因素相互协调作用的结果,一旦特定因素失衡将引起相关疾病的发生。近年来不断有研究发现,DNA去甲基化过程的一类中间产物5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hm C)作为一种新的表观遗传标记,在神经系统中高水平分布,并参与认知、记忆等重要的神经功能。5hm C的形成由氧合酶家族分子(ten-eleven translocation protein,TET)催化,在多种神经系统相关疾病中,5hm C水平和TETs分子的表达都发生改变,提示TET-5hm C表观遗传机制在复杂的神经系统发生发展过程中发挥了重要的调控作用。此外,作为基因表达调控的DNA标记物,5hm C的基因定位与基因表达水平的关系也是重要的研究方向。本文就近年来5hm C和TET家族蛋白分子在神经系统发育和相关疾病方面的重要研究发现进行了综述总结,希望为相关领域研究人员深入开展研究提供重要的思路,并为相关疾病设计治疗策略提供理论支持。

克隆造血DNMT3A基因突变、Tet2基因缺失对慢性阻塞性肺疾病炎症反应调控作用的研究进展

克隆造血是指造血系统体细胞基因突变的非恶性增殖性现象,可驱动基因突变后的突变白细胞比例升高。新近研究指出,由白血病驱动基因突变引起的克隆造血可通过促炎反应影响慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发生发展。越来越多的研究显示,克隆造血是COPD的非传统、独立的危险因素,同时也是导致COPD发生的一种新机制。甲基化DNA转移酶3a(DNMT3A)基因突变及Tet2基因缺失是体细胞突变最常见的两种类型,二者可诱导炎症反应的发生,引起肺功能下降,从而导致COPD的发生发展。深入研究DNMT3A基因突变及Tet2基因缺失与COPD炎症反应的关系,可为研究COPD发生发展的相关机制提供新思路。

胸腺嘧啶脱氧核糖核酸糖基化酶的研究现状及进展

胸腺嘧啶脱氧核糖核酸糖基化酶(thymine DNA glycosylase,TDG)属于单功能尿嘧啶脱氧核糖核酸糖基化酶(uracil DNA glycosidase,UDG)超家族中的成员,在基因组稳定和表观遗传调控中具有双重作用。TDG参与调控DNA甲基化(DNA methylation)和去甲基化(DNA demethylation)。DNA甲基化主要为胞嘧啶(cytosine,C)甲基化,是指胞嘧啶以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl Methionine,SAM)为甲基供体,在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)的作用下,在胞嘧啶第5位碳原子上加上一个甲基,形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)。5mC广泛存在于哺乳动物基因组中,并在基因组稳定性维持、组织特异性基因沉默、逆转录转座子沉默等诸多生物学过程中发挥重要作用。DNA去甲基化是指5mC还原为C,这个过程也是由DNMTs完成的。DNA去甲基化包括被动去甲基化和主动去甲基化2种途径。被动DNA去甲基化是指在DNA复制过程中,新合成的子链DNA未能维持甲基化状态,导致DNA甲基化的被动稀释(passive dilution);DNA主动去甲基化过程不涉及DNA复制,是指通过TDG等酶的作用去除5mC和5-羧基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)的氧化产物,即5-甲羟基胞嘧啶(5-formylcytosine,5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC)。TDG还通过碱基切除修复途径(base excision repair,BER)切割糖与靶碱之间的N-糖苷键,在纠正错配及损伤的DNA碱基对(base pair,bp)中起重要作用。最近的研究表明TDG还在转录调控、胚胎发育及肿瘤治疗等领域发挥重要作用。本文总结了近年来TDG的研究现状及进展,为进一步的深入研究提供理论支持。

脱氧核糖核酸甲基化与胃癌RASSF1A基因失活的相关性研究

胃癌的发生发展是遗传因素、环境因素、癌基因激活、抑癌基因缺失等多步骤参与的渐进过程。RASSF1A基因是最近确定的一种候选抑癌基因，它在多种人类恶性肿瘤中因启动子区甲基化而致表达缺失。DNA甲基化是指在具有胞嘧啶甲基转移活性的DNA甲基转移酶（DNMT）催化下，将甲基基团转移至某些基因的碱基上并进行转录水平调控。DNMT1是维持机体现有DNA甲基化模式的关键因素。

地西他滨对伴有DNMT3A、TET2基因突变的老年骨髓增生异常综合征患者甲基化水平的影响

目的观察地西他滨在伴有DNA甲基转移酶(DNMT)3A基因、TET2基因突变的老年骨髓增生异常综合征(MDS)患者去甲基化治疗中的作用。方法回顾性分析2014年1月至2019年10月使用地西他滨治疗的100例老年MDS患者临床资料,将其中无基因突变的68例MDS患者纳入对照组,将伴有DNMT3A基因突变的10例MDS患者纳入DNMT3A突变组,将伴有TET2基因突变的22例MDS患者纳入TET2突变组。患者均采用地西他滨治疗,每4 w为1个疗程,治疗4个疗程。治疗4个疗程后,比较3组治疗效果、DNMT3A、TET2基因表达水平及不良反应发生率。结果3组临床疗效差异有统计学意义(P<0.05),其中TET2突变组总缓解率(ORR)高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而DNMT3A突变组与对照组、TET2突变组ORR比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗4个疗程后,DNMT3A突变组DNMT3A基因表达水平低于治疗前,但DNMT3A突变组治疗前、治疗4个疗程后DNMT3A基因表达水平均高于对照组、TET2突变组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗4个疗程后,TET2突变组TET2基因表达水平低于治疗前,但TET2突变组治疗前、治疗4个疗程后TET2基因表达水平高于对照组、DNMT3A突变组,差异有统计学意义(P<0.05)。3组不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论地西他滨治疗伴有DNMT3A、TET2基因突变的老年MDS疗效显著,且较无基因突变患者更佳,药物使用后可有效抑制DNMT3A、TET2基因表达,在老年MDS患者去甲基化治疗中发挥重要作用,安全性较高。

TET酶及其中间产物的研究进展

DNA甲基化的形式主要包括以下3种：5-甲基胞嘧啶（5mC）、N6-甲基嘌呤（N6mA）以及7-甲基鸟嘌呤（7mG）[1].目前,研究得最为广泛也最为透彻的就是主要存在于CpG岛中胞嘧啶的甲基化修饰,即5 mC.在哺乳动物基因组中大约有70%-80%的CpG岛区域的胞嘧啶存在甲基化修饰[2].而CpG岛的甲基化是基因沉默的一个重要标志,在调控基因表达过程中发挥着至关重要的作用.

TET酶的生物学功能及相关机制的研究进展

DNA甲基化(DNA methylation)及去甲基化属于常见的表观遗传修饰,可介导多种生理和病理过程。DNA甲基化及去甲基化修饰参与基因的表达调控,且二者的动态平衡可以维持遗传表达稳定性。DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)主要包括DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L,DNA去甲基化酶(DNA demethylase)主要指10-11易位蛋白(ten-eleven-translocation protein,TET)家族,包括TET1、TET2、TET3,是调节DNA甲基化和去甲基化的重要酶类。TET酶是目前发现的调节DNA去甲基化(DNA demethylation)过程中最重要的酶。综述了TET酶在DNA去甲基化修饰中的作用机制,探讨了DNA去甲基化酶在生长发育和疾病中的关键作用,以期为今后表观遗传学的相关研究提供新思路。

TET酶及其中间产物5hmC研究进展

DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰,在胚胎重编程、干细胞分化和肿瘤的发生中发挥调控作用。TET(ten-eleven translocation)酶为关键的去甲基化酶,可连续将5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydro-xymethylcytosine,5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine,5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC),这些碱基代表DNA的表观遗传修饰状态,同时调控DNA去甲基化的进程。研究TET蛋白如何调控DNA甲基化修饰和基因的表达有助于我们深入了解正常的生长发育和人类疾病的表观调控。

过氧化物酶体增殖物活化受体–α基因表达与甲基化的关系

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)–α的表达与甲基化的关系及检测甲基化位点。方法:将人正常肝细胞L02细胞株(L02细胞)分为正常组、油酸组、正常+5–氮杂–2′–脱氧胞苷(5–Aza–CdR)组、油酸+5–Aza–CdR组。生化仪检测细胞内三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)及上清液TG、TC、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量;油红O染色观察细胞脂肪沉积量;逆转录聚合酶链反应(RT–PCR)检测PPAR–α信使核糖核酸(mRNA)表达;焦磷酸测序检测PPAR–α启动子区甲基化水平。结果:(1)与正常组比较,油酸组细胞内TG、TC及上清液ALT、AST升高,油红染色可见明显脂滴沉积,PPAR–α mRMA表达下降,PPAR–α启动子区–273、–234位点甲基化率升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)与油酸组比较,油酸+5–Aza–CdR组细胞内TG、TC及上清液ALT、AST下降,油红染色脂滴沉积减少,PPAR–α mRMA表达增加,在PPAR–α启动子区–273、–234位点甲基化率降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:5–Aza–CdR可通过降低PPAR–α启动子区甲基化率,促进PPAR–α表达,改善非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的脂肪变性。

不明原因复发性流产患者绒毛组织中DNA低甲基化及机制

目的探究不明原因复发性流产(URSA)患者绒毛组织全基因组甲基化水平和甲基化相关酶基因表达情况。方法选取URSA患者31例(URSA组)及同期正常早孕放弃妊娠行人工流产的妇女30例(对照组)。取绒毛组织,采用ELISA测定绒毛组织中总DNA的甲基化水平,实时定量PCR检测DNA甲基化转移酶1(DNMT1)、DNMT3a、DNMT3b、去甲基化酶10-11转位酶1(TET1)、TET2、TET3的mRNA水平,Western blot法检测DNMT1、DNMT2、DNMT3、TET1、TET2、TET3蛋白水平。免疫化学染色检测绒毛组织中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、TET1、TET2、TET3的表达和分布。结果与对照组相比,URSA组的全基因组甲基化水平显著降低,URSA组绒毛组织中DNMT1、DNMT3b的mRNA和蛋白水平显著降低,TET1、TET2的mRNA和蛋白水平显著增加。结论URSA妇女的流产绒毛组织呈现出低甲基化水平的状态,可能与DNMT1、DNMT3b上调,TET1、TET2下调有关。

血管免疫母T细胞淋巴瘤患者RHOA、TET2和DNMT3A基因突变率及临床特征分析

目的探讨血管免疫母T细胞淋巴瘤(AITL)患者RHOA、TET家族羟化酶2(TET2)和甲基化转移酶3A(DNMT3A)基因突变率及临床特征分析。方法应用免疫组化法检测AITL患者组织中RHOA、TET2和DNMT3A的表达。采用多重PCR扩增和测序方法分析RHOA、TET2和DNMT3A突变主要基因型。结果免疫组化结果可知,RHOA阳性表达为68.33%(41/60)、TET2阳性表达为61.67%(37/60)和DNMT3A阳性表达为70.00%(42/60)。RHOA、TET2和DNMT3A阳性表达与血管免疫母T评分明显相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。RHOA、TET2和DNMT3A阳性表达与AITL患者性别及年龄不具有突变与血管免疫母T细胞淋巴瘤TNM分期、LDH含量、有无B症状及IPI评分明显相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 RHOA、TET2和DNMT3A突变可以作为诊断AITL的分子标志物,RHOA、TET2和DNMT3A突变可能参与调节AITL发生发展。

弥漫大B细胞淋巴瘤中TMS1基因启动子甲基化异常的研究

目的:研究弥漫大B细胞淋巴瘤中甲基化诱导沉默基因1(TMS1)基因启动子甲基化及其与弥漫大B细胞淋巴瘤不同细胞起源类型之间的相关性。方法:应用免疫组织化学方法检测40例弥漫大B细胞淋巴瘤石蜡包埋组织中CD10、Bcl6和MUM1的表达,并进一步区分生发中心与非生发中心B细胞起源类型;甲基化特异性PCR技术检测TMS1基因启动子甲基化状态。结果:弥漫大B细胞淋巴瘤40例中,生发中心B细胞起源16例,非生发中心B细胞起源24例。弥漫大B细胞淋巴瘤14例中存在TSM1/ASC基因异常甲基化,其中生发中心B细胞起源2例(12.5%),非生发中心B细胞起源12例(50.0%),两者阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:TSM1基因启动子甲基化在弥漫大B细胞淋巴瘤中常见,且对非生发中心B细胞起源发生进展更为重要。

桔梗皂苷D增强人直肠癌耐药细胞株SW1463/Oxa对奥沙利铂的敏感性

目的探讨桔梗皂苷D对人直肠癌耐药细胞株SW1463/奥沙利铂(Oxa)化学治疗敏感性的增强作用。方法取人直肠癌细胞系SW1463,建立稳定的耐奥沙利铂细胞株SW1463/Oxa。将构建成功的人直肠癌耐药细胞株SW1463/Oxa随机分为桔梗皂苷D组、Oxa组、桔梗皂苷D+Oxa组和对照组。MTT法检测细胞增殖曲线;RT-qPCR检测脱氧核糖核酸甲基转移酶3a(DNMT3a)、磷酸化组蛋白γ-H2AX、DNA双链修复蛋白RAD51、信号传导子和转录激活子3(STAT3)信使核糖核酸(mRNA)表达;Western blot检测细胞DNMT3a、γ-H2AX、RAD51、STAT3蛋白表达及磷酸化STAT3(p-STAT3)水平。结果成功构建人直肠癌耐药细胞株SW1463/Oxa;与对照组和Oxa组比,桔梗皂苷D组和桔梗皂苷D+Oxa组细胞增殖能力、DNMT3a、RAD51、STAT3 mRNA和蛋白表达以及p-STAT3水平降低(P<0.05),γ-H2AX mRNA和蛋白表达升高(P<0.05)。结论桔梗皂苷D能增强人直肠癌耐药细胞株SW1463/Oxa对Oxa的化疗敏感性,推测是通过抑制DNMT3a、RAD51、STAT3的表达,促进γ-H2AX的表达实现此作用的。

5-羟甲基胞嘧啶在消化道肿瘤中的研究进展

表观遗传学参与肿瘤的发生和发展,胞嘧啶第五位碳原子甲基化的产物5-甲基胞嘧啶(5-mC)是脱氧核糖核酸(DNA)主要表观遗传修饰。5-mC由甲基脱氧核糖核酸酶(TET)家族酶催化,首先氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC),其次是5-甲酰基胞嘧(5-fC),最后氧化成为5-羧基胞嘧啶(5-caC)。国内外研究表明,实体肿瘤组织中5-hmC明显下降,5-hmC通过影响基因的结构和功能,调控基因表达,参与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和转移。

CMC-g-DNA接枝共聚物的合成与表征

在磷酸盐缓冲溶液中用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基纤维素钠(CMC)侧链上的羧基;在室温下再将活化的CMC与5'端经氨基修饰的单链脱氧核糖核酸(DNA)齐聚物(ODNs)反应,获得CMC上接枝ODNs的共聚物(CMC-g-ODNs),以Lambda DNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR),将接枝的ODNs扩增为长度为1300个碱基对的双链DNA,从而制得CMC侧链上接枝DNA的共聚物CMC-g-DNA.采用傅里叶红外光谱仪测定CMC与NHS形成的中间体;用水平式琼脂糖凝胶电泳和垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对CMC-g-DNA接枝共聚物进行表征.结果表明,合成了CMC-gDNA接枝共聚物,且在酸性条件下CMC的活化效果更好;同时,接枝在CMC上的DNA在琼脂糖凝胶电泳中迁移速率加快,而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速率减慢.

十八酸乙酯调控Tet酶促神经干细胞定向分化

目的探讨龟板有效成分十八酸乙酯对神经干细胞定向分化为多巴胺能神经元的影响及作用机制。方法使用SD胎鼠(E14.5-E17.5),取大脑基质进行神经干细胞分离培养。通过免疫荧光法检测Nestin用于神经干细胞鉴定,并使用NSE、GFAP对其多向分化能力进行鉴定。分别使用浓度为0.3μg/mL、3μg/mL、30μg/mL的十八酸乙酯对神经干细胞诱导分化5天。采用qRT-PCR、Western blot、免疫荧光染色、DNA斑点杂交等方法检测酪氨酸羟化酶(TH)、TET酶及DNA羟甲基化的表达水平,采用siRNA沉默Tet1基因。结果体外分离培养的细胞球呈Nestin阳性表达,贴壁分化后表达NSE和GFAP蛋白,表明该细胞具有神经干细胞的生物学特性。Western blot结果显示,十八酸乙酯诱导组的TH蛋白表达上调且量效关系明显,其中30μg/mL十八酸乙酯的作用最为显著。免疫荧光结果显示,十八酸乙酯诱导组的TH阳性表达增加。DNA斑点杂交(Dot-Blot)结果显示,十八酸乙酯诱导组5hmC整体水平显著升高。qRT-PCR结果显示,十八酸乙酯诱导组的Tet1表达显著上调差异具有统计学意义(P<0.05),而Tet2、Tet3的表达无明显改变。siRNA干扰结果显示,siTet1组的TH表达显著降低差异具有统计学意义(P<0.05),与siTet1组相比较,siTet1+十八酸乙酯诱导组的TH表达无明显上调差异无统计学意义(P>0.05)。结论十八酸乙酯能够通过调控Tet1有效地诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元。

《解剖学报》可以直接使用的英文及英文缩略词

一、以下词汇在文中首次出现时可直接用英文缩略词 CT（计算机X线断层摄影术） DAB（二氨基联苯胺） DMEM（缓冲液培养基） DMSO（二甲基亚砜） DNase（脱氧核糖核酸酶） ECL（增强型化学发光法） EDTA（乙二胺四乙酸） ELISA（酶联免疫吸附测定） FITC（异硫氰酸荧光素） GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶） GFAP（胶质纤维酸性蛋白） HRP（辣根过氧化物酶）

《解剖学报》可以直接使用的英文及英文缩略词

一、以下词汇在文中首次出现时可直接用英文缩略词CT（计算机X线断层摄影术）MRI（磁共振成像）DAB（二氨基联苯胺）DMEM（缓冲液培养基）DMSO（二甲基亚砜）DNase（脱氧核糖核酸酶）MTT（四甲基偶氮唑盐）OCT（包埋剂）PB（磷酸缓冲液）PBS（磷酸盐缓冲液）