甲基茉莉酮酸对悬浮培养南方红豆杉细胞自由基清除系统酶的影响

目的 研究外加甲基茉莉酮酸对南方红豆杉 Taxus chinensis var.mairei细胞培养体系氧自由基清除系统中超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化物酶 (POD)和过氧化氢酶 (CAT)酶活的影响规律。方法 酶活分析技术。结果 甲基茉莉酮酸能够诱导南方红豆杉细胞 SOD的活性 ;对 POD活性的诱导作用极为显著 (约为对照组的 10倍 )且POD活性在培养第 10天达到峰值 ;在甲基茉莉酮酸作用下 CAT活性先升高后降低 ,即在表现出较强的诱导作用之后又抑制了 CAT的酶活水平。结论 甲基茉莉酮酸的加入刺激细胞产生了防御应答反应 ,诱导了相关的自由基清除酶类 ,其中

甲基茉莉酮酸对悬浮培养南方红豆杉细胞代谢的影响

目的 探讨甲基茉莉酮酸作用下悬浮培养南方红豆杉细胞的系列生理生化反应。方法 TTC(2 ,3,5 -triphenyltetrazolium chloride)和蛋白含量测定方法以及酶活分析技术。结果 甲基茉莉酮酸不仅强烈抑制细胞活力 ,使细胞初生代谢受到显著抑制 ,并且还诱导 PAL (苯丙氨酸解氨酶 )活性增强 ,在一定程度上抑制了 PPO(多酚氧化酶 )的活性 ,使胞外酚含量增加且极大峰比对照提前约 3d出现。结论 甲基茉莉酮酸不仅促进细胞由初生代谢提前向次生代谢转化 ,并且能够增强细胞的次生代谢 ,有利于细胞相关次生代谢产物的合成。

甲基茉莉酸酯对花生种子萌发和贮藏物质降解的影响

甲基茉莉酸酯（Me-Ja）对花生种子萌发基本没有影响，但对下胚轴和根的生长有抑制作用，且与浓度正相关．低浓度Meja促进子叶淀粉酶活性和淀粉降解，高浓度作用相反。Me-Ja部分抑制脂肪降解、贮藏蛋白降解和内肽酶活性，明显抑制脂肪酶活性．文中还讨论了Me-a抑制种子萌发与ABA作用的异同。

甲基茉莉酸酯诱导烟草幼苗抗炭疽病与多酚氧化酶活性的关系

探讨了甲基茉莉酸酯（Ｍｅｔｈｙｌｊａｓｍｏｎａｔｅ，Ｍｅ－Ｊａ）诱导Ｋ３２６、广黄５５和巴西３个烟草幼苗抗炭疽病（由毁灭性刺盘胞引起）与多酚氧化酶活性的关系．Ｍｅ－Ｊａ处理烟草幼苗使多酚氧化酶活性明显提高，但只有广黄５５的酶活性与抗炭疽病有较高的相关性，且没有达到显著水平。

甲基茉莉酸对喜树中HMGS基因表达的影响初探

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGS)基因是利用基因工程技术代谢调控喜树碱生物合成的重要靶点和关键酶基因之一,甲基茉莉酸(MJ)是植物次生代谢工程中比较常用的一种化学诱导子,对于活性次生代谢物质的合成及积累具有调控作用。本实验通过用10mg/L甲基茉莉酸喷洒喜树幼苗,来观察其对喜树中HMGS基因表达的调节效应。实验结果表明胚轴在处理12h后,HMGS基因表达量达到峰值,而子叶在被处理后,甲基茉莉酸对HMGS基因有抑制作用。

甲基茉莉醛的合成工艺研究

本文以对甲基苯甲醛与正庚醛为原料,在碱和相转移催化剂作用下经羟醛缩合反应水相中合成香料甲基茉莉醛。用正交试验法对甲基茉莉醛的合成工艺进行优选,最后得到合成甲基茉莉醛的较优工艺:对甲基苯甲醛与正庚醛的投料摩尔比为1.4︰1.0,相转移催化剂苄基三乙基氯化铵用量为正庚醛摩尔数的6%,缓慢滴加正庚醛,控制反应温度65℃,反应5 h,在此较佳条件下甲基茉莉醛的收率约为77.3%。

水杨酸·甲基茉莉酸与伤诱导对烟草sm-Nvas同源基因表达调控的初步研究

[目的]研究Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata这2种烟草中sm-Nvas同源基因分别在经水杨酸(SA)、甲基茉莉酸(MeJA)及伤诱导后的表达情况。[方法]采用Trizol法提取经水杨酸、甲基茉莉酸及伤处理后的2种烟草叶片的总RNA,转录成cDNA,利用实时荧光定量PCR检测sm-Nvas同源基因的表达量并进行数据分析。[结果]通过对烟草叶片中sm-Nvas同源基因的表达量分析,结果表明水杨酸、甲基茉莉酸及伤处理能对sm-Nvas同源基因的表达起调控作用。[结论]用SA、MJA和伤处理Nicotiana sylvestris和Nicotiana attenuata烟草,发现sm-Nvas的表达量均有所增加。在处理8 h后其表达量发生了明显的变化,在12~16 h其表达量的增加达到峰值。这对研究烟草的sm-Nvas及其同源基因的功能奠定重要的基础。

茉莉酸羧基甲基转移酶基因的克隆及其高效表达载体的构建

以拟南芥花为材料,应用RT-PCR方法克隆拟南芥茉莉酸甲酯合成途径中重要的限速酶——茉莉酸羧基甲基转移酶基因,并进行生物信息学分析,以pCAMBIA1304+为基本载体构建其植物高效表达载体pCAM-BIA1304+-AtJMT.克隆到的AtJMT编码区序列为1 170 bp,编码389个氨基酸的多肽.生物信息学分析该蛋白理论分子量为43.37 kD,等电点为5.18.三级结构预测表明其具有典型的羧基甲基转移酶蛋白功能域甲基供体的结合位点,蛋白质三维模型具有典型的甲基转移酶的蛋白立体结构.获得的工程菌可用于遗传转化长春花等,为萜类吲哚生物碱代谢工程新型策略奠定基础.

紫苏茉莉酸羟基甲基转移酶基因PfJMT的克隆及表达分析

【目的】茉莉酸羟基甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)是植物茉莉酸甲酯生物合成的关键酶,通过克隆紫苏JMT,并研究其在不同胁迫下和种子不同发育时期的表达模式,为研究JMT在植物防御和种子发育中的作用提供理论依据。【方法】根据紫苏种子转录组测序结果设计引物,从紫苏中克隆得到紫苏茉莉酸羟基甲基转移酶基因的DNA和cDNA序列,命名为PfJMT,通过生物信息学分析该基因的结构、稳定性、亲水性、亚细胞定位及保守结构域等,利用系统进化树分析PfJMT和其他物种JMT蛋白的进化关系。取开花期的紫苏根、茎、叶、花等组织用于组织特异性表达分析。取开花后5、10、15、20、25和30 d的种子用于JMT在种子不同发育时期表达模式的研究。用25μmol·L^(-1)茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)和1 mmol·L^(-1)水杨酸(salicylic acid,SA)喷洒处理具有4片真叶的紫苏幼苗并浇灌根部,分别于处理0、2、4、8、16、24和48 h后取样,研究JMT在不同胁迫下的表达模式。【结果】PfJMT的ORF长1 050 bp,编码349个氨基酸。生物信息学分析表明,PfJMT为不稳定的亲水蛋白,亚细胞定位于细胞质,含有一个甲基转移酶-7(Methyltransf-7)保守结构域。通过与其他物种的JMT蛋白多序列比对发现,紫苏JMT和丹参JMT的序列一致度最高,为80.5%,和水稻的序列一致度最低,为36.8%。在对多种不同植物基于JMT蛋白构建系统进化树的分析中发现紫苏和拟南芥、丹参等双子叶植物亲缘关系较近,而与建兰、水稻等单子叶植物亲缘关系较远,说明JMT在单子叶和双子叶植物的进化过程中可能存在较大的差异。荧光定量PCR结果表明,PfJMT在紫苏根和茎中的相对表达量最低,叶和花中的相对表达量比根和茎中略高,在开花后5d的种子中的表达量最高,并且随着种子的发育表达逐渐下调,说明JMT在种子发育中起着重要作用。在使用外源MeJA和SA处理的紫苏根、叶组织中,PfJMT表达均显著下调,这一结果支持JMT可能不直接参与防御反应,而是通过调节JA水平间接参与植物防御的理论。【结论】成功克隆获得PfJMT,随着种子的发育PfJMT表达量逐渐下调,并在外源MeJA、SA胁迫下表达量显著下调。

茉莉酸甲酯对杜氏盐藻β-胡萝卜素含量的影响

研究甲基茉莉酸（MeJA）对杜氏盐藻生长、β-胡萝卜紊含量及叶绿素含量的影响．在盐藻生长基本培养基中分别添加0μmol·L^-1、50μmol·L^-1、100μmol·L^-1、200μmol·L^-1、500μmol·L^-1、1000μmol·L^-1和2000μmol·L^-1。MeJA，每隔2d取样，测定盐藻细胞生长、β-胡萝卜素含量及叶绿素含量．研究结果表明：低MeJA浓度（50～500μmol·L^-1）对盐藻的生长无显著的影响，高MeJA浓度（1000～2000μmol·L^-1）对盐藻的生长有显著的抑制作用．盐藻β-胡萝卜素及叶绿素含量随着MeJA浓度的升高，呈现先升高后降低的趋势，100μmol·L^-1MeJA处理盐藻时其β-胡萝卜素含量最高，200μmol·L^-1MeJA处理盐藻时其叶绿素含量最高．方差分析结果表明：MeJA对盐藻的生长、类胡萝卜紊及叶绿素含量有极显著影响（Jp〉0．01），MeJA是诱导盐藻次生代谢产物积累的一个有效的诱导因子．

月季茉莉酸羧基甲基转移酶基因RhJMT对花瓣衰老的调控

为了解茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)在花瓣衰老中的作用机制,以月季‘Samantha’为材料,在花瓣中克隆了MeJA生物合成关键酶茉莉酸羧基甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)基因RhJMT。同源蛋白序列比对和系统进化树分析表明,RhJMT具有保守的Methylyransf_7超家族结构域,属于SABATH蛋白家族。实时荧光定量PCR结果表明,RhJMT的表达量在花瓣进入衰老期后显著升高。通过病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术对RhJMT进行功能验证,结果表明沉默RhJMT显著延缓花瓣衰老,外源施加MeJA能够抵消沉默RhJMT对花瓣衰老的延缓作用。以上结果说明RhJMT能够促进花瓣衰老,可能是通过控制MeJA的含量来发挥作用。

绿色杜氏藻DHDDS基因生物信息学分析及表达研究

绿色杜氏藻是一种能产生重要次生代谢产物类胡萝卜素的单细胞绿藻,脱氢多萜醇焦磷酸合成酶(dehydrodolichyl diphosphate synthase,DHDDS)是其在类胡萝卜素合成途径中的相关酶。旨在研究DHDDS基因表达与类胡萝卜素含量之间的关系。提取绿色杜氏藻总RNA,通过转录组测序获得DHDDS基因全长,对该基因进行生物信息学分析;并用不同浓度甲基茉莉酸(Me JA)处理绿色杜氏藻,采用实时定量PCR研究该基因转录差异。结果显示,绿色杜氏藻DHDDS基因全长2 211 bp,含有一个1 740 bp长的开放阅读框(ORF),编码579个氨基酸序列。DHDDS蛋白质理论等电点为7.63,相对分子质量为62 472.7 Da。预测结果表明,DHDDS蛋白不含信号肽,也不存在跨膜区域,该蛋白定位于细胞质基质。氨基酸序列比对结果显示,绿色杜氏藻DHDDS蛋白与小球藻的同源性最高(59%)。实时定量PCR结果表明,经100μmol/L Me JA处理的绿色杜氏藻DHDDS表达水平最高,具有极显著差异;在该浓度下,类胡萝卜素含量均高于其他浓度组。且DHDDS基因的表达与类胡萝卜素含量呈一定的相关性。绿色杜氏藻DHDDS是一种定位于细胞质基质中的酶,其与绿色杜氏藻类胡萝卜素合成途径有关。在一定浓度范围的Me JA诱导下,低浓度的Me JA对其表达起促进作用,高浓度Me JA对其表达有抑制作用,且其表达与类胡萝卜素含量呈一定的相关性。

红景天愈伤组织诱导及红景天苷积累的研究

通过对红景天叶片、茎、根产生愈伤组织的培养,建立了培养周期短、愈伤组织生长效率高的培养体系。利用多因子正交实验设计及分析,筛选出最佳愈伤组织诱导培养基是MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 0.1 mg/L 2,4-D。通过甲基茉莉酸的添加研究诱导愈伤组织生物量及药效物质积累的影响,发现甲基茉莉酸浓度对愈伤组织生物量及药效物质红景天苷积累有显著影响,其中25.0 mg/L MeJA对愈伤组织生物量及红景天苷的积累效果最好。因此,通过培养愈伤组织是一种获得大量红景天活性物质的有效方法,为红景天产品的生产提供一种原材料途径。

1个烟草糖基转移酶启动子在拟南芥中的表达

从烟草中克隆到1个受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导的糖基转移酶基因GT-MS,将其翻译起始位点5′上游-800^+1启动子序列取代pCAMBIA1301质粒的35S启动子,构建GT-MS启动子与Gus基因融合的植物表达载体,采用花序浸染法转化拟南芥,得到阳性植株。对转基因植株进行组织化学染色,结果表明,GT-MS启动子在拟南芥不同生长发育时期及不同器官均有表达,但主要是在维管组织表达,且韧皮部的表达高于木质部。MeJA和SA诱导后GUS活性增强,Gus基因RNA表达量成倍增加。表明GT-MS启动子与在烟草中相似,在拟南芥中也受MeJA和SA诱导。

受MeJA诱导的烟草GTs基因启动子的克隆及转化

利用已克隆的1个受甲基茉莉酸(MeJA)诱导的糖基转移酶(GTs)基因,以PCR扩增得到该基因启动子序列,长度约为1.4kb,用改造后的双元载体pCAMBIA1301与GTs基因启动子连接,构建了含目的启动子与GUS基因的融合基因质粒pCAP-GUS。通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草W38,经PCR检测验证得到了含有融合基因的转基因烟草植株,为进一步研究GTs基因的功能奠定了基础。

绿色杜氏藻GGR基因生物信息学分析及表达研究

采用Illumina HiSeqTM 2000高通量测序方法获得绿色杜氏藻GGR基因(Gen Bank序号:KX100480)cDNA全长序列,研究了甲基茉莉酸(Me JA)对绿色杜氏藻GGR基因表达的影响.测序结果表明,绿色杜氏藻GGR基因cDNA全长2 356 bp,开放阅读框1 539 bp,编码512个氨基酸,分子量为52.296 1 k Da,理论等电点为6.54.序列分析结果表明,该蛋白具有保守的Chl P结构域,为可溶性蛋白,具有跨膜区域,无信号肽.Target P 1.1 Server预测结果表明,该蛋白可能定位于线粒体.系统进化树结果表明,绿色杜氏藻GGR蛋白较其他植物的GGR蛋白亲缘关系较远.RT-PCR结果表明,100μmol·L-1 Me JA可显著地提升绿色杜氏藻GGR基因的表达(P<0.01).同时,绿色杜氏藻叶绿素和类胡萝卜素含量达到最高,说明GGR基因与绿色杜氏藻叶绿素和类胡萝卜素的合成存在一定关系.

丹参茉莉酸甲基转移酶蛋白表达和纯化的研究

茉莉酸甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)是茉莉酸生物合成途径中的关键酶,能够催化茉莉酸甲基化形成茉莉酸甲酯。本研究将丹参茉莉酸甲基转移酶基因(SmJMT1)c DNA构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。SDS-PAGE凝胶电泳结果表明该蛋白的大小约66 kDa,与预测的蛋白分子质量相同;同时对影响蛋白表达的4个因素:诱导时间、诱导温度、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度及诱导前菌液的浓度进行优化,结果表明当诱导前菌液的A600在0.8左右时,加入0.4 mmol·L^(-1)IPTG,20℃诱导培养8 h后SmJMT1蛋白的表达量较高。蛋白质印迹检测显示,anti-GST抗体可以特异性地识别SmJMT1蛋白,证实丹参SmJMT1蛋白在大肠杆菌中表达成功;Q-TOF检测数据检索分析表明,SmJMT1蛋白属于甲基转移酶亚家族。丹参中茉莉酸甲基转移酶SmJMT1的成功表达和纯化对研究茉莉酸生物合成途径及茉莉酸对药用植物次生代谢调控奠定了一定基础。

丹参茉莉酸羧甲基转移酶的原核蛋白表达分析

茉莉酸羧甲基转移酶基因(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)是植物茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)生物合成过程中的关键酶基因,在植物体内可依赖S-腺苷-蛋氨酸(S-adenosyladenylL-methionine,SAM)作为甲基供体,催化茉莉酸(jasmonic acid,JA)形成茉莉酸甲酯。本研究将丹参茉莉酸羧甲基转移酶基因cDNA构建到原核表达载体PET-28a(+)上后转化到大肠杆菌BL21(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。SDS-PAGE凝胶电泳检测结果表明该蛋白的分子量大小约44 kD,与预测的蛋白分子质量大小一致,从而证实丹参JMT基因在大肠杆菌中表达成功。丹参JMT基因在原核细胞表达将对此酶基因的蛋白纯化、体外酶活力检测以及基因功能等研究奠定一定的基础。