甲基营养菌代谢甲醛的异化途径

为了更好地理解甲基营养菌代谢甲醛的机制,对甲基营养菌代谢甲醛的异化途径进行了分析和讨论.包括四氢叶酸途径(THF)、四氢甲烷蝶呤途径(H4MPT)、谷胱甘肽(GSH/MySH)途径.着重分析了甲醛异化作用三种途径的反应过程、涉及到的关键酶及其编码基因.甲基营养菌代谢甲醛异化途径是通过辅酶因子自发地或者在酶的催化作用下使甲醛与C1载体结合并将其氧化为中间产物甲酸,甲酸在甲酸脱氢酶的作用下氧化为CO2.深入研究甲醛异化途径关键酶基因及其功能,是构建净化甲醛工程菌和开发净化甲醛转基因植物的关键.

甲基营养菌MP688胞外多糖合成的影响因素研究

目的：考察培养基组分和发酵条件对甲基营养菌MP688合成胞外多糖的影响，确定最主要的影响因素。方法：将甲基营养菌MP688接种到基础培养基中，通过改变基础培养基的氮源、培养温度、初始pH值和培养时摇床转速等条件，检测在每种条件下培养5 d后发酵液中的多糖含量，确定每种因素的最适范围；进而选取8个因素，通过Plackett-Burman实验设计12组实验，通过检测每种组合条件下的多糖产量和结果统计分析，确定影响多糖合成的最主要因素。结果：甲基营养菌合成胞外多糖的最适氮源为硝酸钠，最适温度为30-37°C，最适pH值为6.5-7.0，最适摇床转速为200-250 r/min；甲醇、硝酸钠、初始pH值和接种量是MP688合成多糖的主要影响因子。结论：运用Plack-ett-Burman实验设计筛选到甲基营养菌MP688胞外多糖合成的主要影响因子，MP688是具有多糖生产潜力的菌株。

甲基营养菌MP681基因组测序文库的构建

目的:建立甲基营养菌MP681基因组文库,用于鸟枪法测序。方法:提取MP681基因组DNA,经超声随机片段化及T4 DNA聚合酶末端修平处理后,与经SmaⅠ酶切、小牛肠碱性磷酸酶(CIP)去磷酸化处理的pUC19载体连接,电击转化大肠杆菌DH5α感受态,并通过末端双向测序对文库质量进行评价。结果:分别构建了2～4 kb和4～6 kb基因组文库,电泳结果显示插入片段长度与预期符合,文库库容均在10万以上。结论:构建了插入片段大小和库容符合要求的甲基营养菌MP681全基因组鸟枪法2～4 kb、4～6 kb测序文库。

甲基营养菌代谢网络途径和代谢工程改造的研究进展

一碳化合物(甲醇或甲烷)高值化转化是当前生物工程领域的重要研究热点。甲基营养菌是一类以甲醇为碳源和能源生长的革兰氏阴性菌,随着基因组测序的开展和各类组学技术的发展,以扭脱甲基杆菌为代表的甲基营养菌的中心代谢网络途径和相关功能基因逐渐明晰。近年来,甲基营养菌中包括基因过表达、基因敲除整合等遗传操作工具的完善以及各种基因调控元件的开发,为甲基营养菌的底盘改造和异源途径优化表达提供了重要基础,国内外的研究推动了甲醇转化成多种高附加值产品。此外,人们渴望利用传统基因工程菌作为底盘构建合成型甲基菌,以期更高效实现甲醇催化转化。本文中,笔者综述了目前甲基营养菌,尤其是扭脱甲基杆菌的代谢网络特点、代谢工程改造策略与应用以及构建合成型甲基细菌这3个方面的研究进展,以期为甲基微生物催化转化的研究提供借鉴。

甲基营养菌MP688甲醇脱氢酶基因mpq1818的敲除及功能研究

目的:研究甲醇脱氢酶基因mpq1818在甲基营养菌MP688生长代谢中的作用。方法:利用同源重组原理构建中间为庆大霉素抗性基因Gmr、两侧mpq1818基因上下游序列同源的敲除载体pAK0-up-Gmr-down,接合转移导入MP688,通过庆大霉素抗性和组合PCR方法筛选基因敲除菌,并检测其生长、甲醇脱氢酶活性、甲醇利用及吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成能力等方面的差异。结果:抗性和PCR验证显示mpq1818缺失株构建成功;与野生菌相比,缺失株的甲醇脱氢酶活力及利用甲醇的能力降低,而且菌株的生长和PQQ产量也有显著下降。结论:基因mpq1818的缺失影响菌株前期生长与PQQ合成。

甲基营养菌甲醇脱氢酶基因的克隆及表达

目的:从甲基营养菌MP681中扩增甲醇脱氢酶(MDH)基因,在大肠杆菌中表达并检测其活性,同时在MP681中考察该基因对吡咯喹啉醌(PQQ)产生的影响。方法:根据MP681基因组序列设计引物,PCR扩增靶基因mdh,构建表达载体,考察活性,利用接合转移转化至MP681,考察PQQ的合成。结果:扩增得到甲基营养菌MP681甲醇脱氢酶基因,在大肠杆菌中的表达产物能够催化甲醇脱氢;将携带mdh基因的质粒转入MP681后,PQQ产量略有提高。结论:获得编码MDH的基因,该基因能够在大肠杆菌中表达,且表达产物具有生物活性;甲醇脱氢酶基因表达对宿主菌的PQQ合成可能有一定影响。

甲基营养菌MP688葡萄糖脱氢酶基因分离鉴定及性质研究

目的:鉴定甲基营养菌MP688中的葡萄糖脱氢酶基因。方法:对甲基营养菌MP688基因组序列进行比对和分析,找到与已知细菌葡萄糖脱氢酶同源性最高的基因序列mpq_2164,且该基因所编码蛋白经分析具有跨膜结构域。设计引物扩增mpq_2164和缺失跨膜区域序列的s-mpq_2164,将PCR产物克隆到表达载体pET-15b上,在大肠杆菌BL21中完成异源重组表达,然后通过组氨酸标签镍柱亲和层析纯化,采用DCIP法测定葡萄糖脱氢酶的活力。结果:分离了甲基营养菌MP688中的葡糖糖脱氢酶基因,并实现了s-mpq_2164的高效异源重组表达;MPQ_2164的氨基酸序列与已知的葡萄糖脱氢酶相似性很低,但酶活测定结果表明S-MPQ_2164具有很高的葡糖糖脱氢酶活性。结论:MPQ_2164是一个依赖于吡咯喹啉醌的葡萄糖脱氢酶,去掉跨膜结构域有利于该蛋白的异源表达。

通过转座诱变筛选甲基营养菌吡咯喹啉醌合成缺陷突变株

目的:对电转化等Tn5转座诱变条件进行优化,获得大量甲基营养菌MP688突变株,筛选吡咯喹啉醌(PQQ)合成缺陷突变株,并对失活基因进行鉴定。方法:通过电击方法对MP688株进行Tn5转座诱变;通过检测PQQ产量,选择不产或几乎不产PQQ的突变株,用质粒拯救的方法鉴定突变基因。结果和结论:确定了MP688株电击转化的最优条件,优化了质粒拯救法鉴定突变基因的实验方案,得到了1株PQQ合成明显降低的突变株RM16,并确定了转座子在染色体上的插入位点。

甲基营养菌代谢过程新进展与代谢工程改造

甲基营养菌是一类能够利用有机碳一(C1)作为唯一碳源和能源进行生长的微生物,其中心代谢具有特殊性、复杂性和多样性的特点,是研究C1同化、异化和合成代谢的重要对象。近年来,随着甲基营养菌的系统组学研究技术日趋成熟,分子遗传改造工具和分子元器件的不断开发和完善,研究者们对甲基营养菌中心代谢过程和调控机制的认识逐步深化。基于此,系统阐述了甲基营养菌依赖于稀土元素的代谢调控机制,以及甲烷氧化菌中心代谢的新认知和甲醇利用菌途径工程的新策略,为进一步对甲基营养菌的代谢改造和高值产品开发提供一定的参考。

甲基营养菌MP688中启动子探针载体的构建

目的:以半乳糖苷酶基因作为报告基因,构建适于探测甲基营养菌MP688启动子的载体。方法:通过PCR扩增半乳糖苷酶基因片段,连入质粒pCM66构建启动子活性探针载体pMPlacZ。根据MP688的基因组序列设计引物,通过PCR扩增5个pqqA基因、核糖体亚基A基因(rpsA)、核糖体亚基B基因(rpsB)、伴侣分子groel基因和甲醇脱氢酶基因(mdh)等共9个基因的启动子序列,将这9个启动子片段连入pMPlacZ进行活性测定。结果:构建了一个适于探测甲基营养菌MP688的启动子活性的载体pMPlacZ;利用构建的报告系统对MP688中9个基因的启动子进行了活性比较,得到3个与吡咯喹啉醌合成相关的强启动子。结论:构建的启动子活性检测载体可以有效、灵敏地用于MP688强启动子的筛选和启动子活性检测。

通过突变甲醇脱氢酶启动子提高甲基营养菌吡咯喹啉醌产量

目的:考察甲基营养菌J1-1甲醇脱氢酶启动子活性与吡咯喹啉醌(PQQ)产量的相关性。方法:通过定点突变甲醇脱氢酶P0771启动子,利用lacZ作为报告基因检测突变启动子的转录水平,筛选出活性下降的突变启动子在J1-1中替换天然启动子获得突变菌株,检测突变菌株甲醇脱氢酶表达、酶活以及菌体生长和PQQ产量。结果:定点突变了7个P0771启动子,利用lacZ作为报告基因筛选出2个启动活性较天然启动子下降的突变启动子P0771-1、P0771-5,替换J1-1中天然启动子获得的突变菌株甲醇脱氢酶酶活都低于J1-1,在增菌培养基中其PQQ的合成水平分别提高约9.76%、11.6%。结论:通过启动子突变,降低甲醇脱氢酶启动子活性可以提高J1-1的PQQ产量。

吊兰叶际和根际甲基营养菌的分离与鉴定

[目的]为了分离鉴定吊兰附生甲基营养菌。[方法]通过微宇宙方法对吊兰进行甲醇和甲醛喷施和熏蒸30 d,采用水洗、过滤和离心从吊兰叶际和根际采样;优化的甲基营养菌无机盐筛选培养基中添加1%(V/V)甲醇和0.1%甲醛(V/V)混合液为仅有碳源,并添加50 mg/L放线菌酮抑制真菌生长;结合16S rDNA技术,鉴定菌株类型。[结果]分离鉴定12株甲基营养菌,其中叶际分离甲基营养菌属菌株和根际分离分支杆菌属菌株分别显示出叶、根代表性甲基营养菌特征,可分别耐受0.1%(V/V)和0.3%(V/V)的甲醛。[结论]该研究建立了吊兰附生甲基营养菌的一种有效分离和鉴定方法。

甲基营养菌MP688基因组完成图构建

目的:在Solexa测序建立的甲基营养菌MP688基因组精细图的基础上,构建MP688基因组完成图。方法:根据MP688基因组序列设计引物,进行常规PCR扩增,填补Scaffold内部缺口;利用BLASTN、BLAT软件分析预测6个Scaffold定位关系;通过组合PCR、长距离PCR等填充Scaffold间的物理缺口。结果:常规PCR填充Scaffold内部4个缺口;BLASTN、BLAT软件分析预测了Scaffold定位关系;组合PCR填充Scaffold间的2个物理缺口,长距离PCR填充其余4个物理缺口。结论:得到了MP688的基因组完成图,为MP688的吡咯喹啉醌生物合成途径的阐明和进一步的代谢工程育种奠定了基础。

利用纸层析-分光光度法检测甲基营养菌5222产L-丝氨酸

该研究旨在建立一种准确、简便的检测L-丝氨酸含量的方法。当纸层析-分光光度法展开剂为丙酮∶正丁醇∶二乙胺∶水(10∶10∶2∶5,V/V),pH值为12.7,波长为510 nm,洗脱时间为30 min时,能很好的对L-丝氨酸进行定性、定量检测。当L-丝氨酸标准溶液质量浓度在1~6μg/mL时,L-丝氨酸的含量(x)与吸光度值(y)之间有良好的线性相关关系(回归方程y=0.0088x+0.0089,R2=0.9962);精密度实验结果显示相对标准偏差(RSD)为2.3%;回收率实验结果显示平均加标回收率95.3%,RSD为2.6%。说明该方法具有较高的精密度和准确度。以甲基营养型菌(Methylobacterium sp.)5222为出发菌株,以甘氨酸为前体物质发酵生产L-丝氨酸,应用该研究建立的纸层析-分光光度法,检测到发酵液中L-丝氨酸含量为0.90 g/L,说明菌株5222具有产L-丝氨酸的能力。

甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1中最适荧光蛋白报告基因的鉴定

近年来荧光蛋白成为基因工程中常用的遗传标记,详尽解读不同荧光蛋白基因在甲基营养菌中的表达可以鉴定最适的荧光报告基因。克隆了常用的绿色荧光蛋白eGFP、红色荧光蛋白mCherry、黄色荧光蛋白YFP以及其他来源的绿色荧光蛋白wGFP和红色荧光蛋白RFP共5种荧光基因,构建相应的表达载体并在甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1中进行表达。通过荧光成像观察和SDS-PAGE蛋白凝胶电泳进行荧光蛋白表达鉴定。通过细菌生长曲线、荧光总量和相对荧光强度的测定,进行荧光稳定性和表达强度的鉴定。结果在转化子中均检测到目的荧光蛋白条带,但RFP荧光表达量痕量且未检测到荧光成像;稳定性最强和相对荧光强度最高的是YFP,是常用eGFP的1.6倍,mCherry的3.4倍。在M. extorquens AM1中最适荧光蛋白为YFP。

甲基营养菌Methylorubrum extorquens AM1抗菌活性物质分离与鉴定

甲基营养菌能够以一碳化合物作为唯一碳源和能源进行生长,培养成本较低,已用来生产多种高附加值产品和药用活性物质。因此,挖掘甲基营养菌的抗菌代谢产物,将为抗菌物质的研发和生产提供研究基础。本研究通过肉汤微量稀释法进行抗菌活性初筛,利用7.5 L发酵罐对活性菌株Methylorubrum extorquens AM1进行放大发酵,采用硅胶柱层析和高效液相色谱等对粗提物进行分离纯化,应用核磁共振、质谱、旋光等手段确定化合物的化学结构,共得到7种化合物,分别为腺苷(1)、5′-S-methyl-5′-thioadenosine(2)、肌苷(3)、尿苷(4)、1,1′-oxybis(2,4-di-tert-butylbenzene)(5)、胸腺嘧啶(6)和烟酰胺(7),其中,化合物1至5为首次在Methylorubrum属的甲基营养菌中分离得到。抗菌活性评价显示化合物1至4对枯草芽孢杆菌、志贺菌和/或金黄杆菌具有一定抑制作用,MIC 50在2.1~375.0μg/mL之间。

甲基营养菌Methylobacterium sp.MB200中部分一碳代谢相关基因的定位及mtdA和mtdB基因的克隆研究

以甲基营养细菌Methylobacterium sp.MB200为出发菌株,首先利用质粒转座子(pTnMod-RKm’)构建了目的菌株MB200的部分突变体库,获得能够在双抗性MMII板上生长的突变体共11552株,然后在双抗性MMI板上复筛获得不能够利用甲醇的突变体333株(初步认为是一碳代谢途径被破坏的突变株),为一碳代谢相关基因的克隆研究奠定了基础。随后利用TAIL-PCR技术快速准确地从突变体库中定位了部分与一碳代谢相关的基因,并根据pTnMod-RKm’具有复制起始位点能够快速克隆插入位点侧翼序列的特性克隆到mtdA和mtdB基因的全序列并进行了初步分析。

甲基营养菌M.sp.MB200中serA基因功能初探

serA基因编码3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH),此酶在合成L-丝氨酸的第一步起催化作用。利用质粒pCM80分别与野生型基因serA、缺失了C末端ACT功能域的突变基因serA△77构建了重组体表达菌MB200/pCM80serA和MB200/pCM80serA△77。通过分析发现野生型基因重组表达菌的PGDH酶活受L-丝氨酸浓度影响较大,当反应体系中的L-丝氨酸浓度为40μmol/L时,酶活减少了约1/3;缺失了ACT功能域的基因表达菌的PGDH酶活基本不变,不受L-丝氨酸浓度的影响。进一步在静息细胞反应条件下,对重组菌和野生菌株MB200进行发酵产L-丝氨酸的研究,实验发现MB200/pCM80serA产L-丝氨酸的量为13.6mg/mL,MB200/pCM80serA△77产L-丝氨酸的量为16.8 mg/mL,而野生型菌株M.sp MB200的产量为6.4 mg/mL,重组菌的L-丝氨酸产量都有所提高,且MB200/pCM80serA△77的产量提高更多。结果证实了甲基营养菌MB200中serA基因与产L-丝氨酸具有反馈抑制关系,为进一步解除反馈抑制并发酵产L-丝氨酸奠定了基础。

甲基营养菌Methylobacterium sp MB200中crtI基因的克隆及表达

八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)催化八氢番茄红素经过4次脱氢合成番茄红素,或者经过3次脱氢合成链孢红素,在类胡萝卜素的生物合成中发挥重要的作用。以甲基营养菌Methylobacterium sp MB200为原始菌株,首先采用转座子突变技术构建部分突变体库共11552株,筛选得到33株颜色发生变化的目的突变体,随后利用分子克隆技术从目的突变体中获得crtI基因的完整ORF,长为1539 bp,编码512个氨基酸。与来自M.populi BJ001、M.chloromethanicum CM4和M.extorquens AM1的crtI一致性均为93%。将crtI与载体pCM80连接得到重组质粒pCM80-crtI,导入原始菌株中得到重组菌MB200/pCM80-crtI。测定原始菌株与重组菌株的CrtI酶活,结果发现,重组菌株CrtI的酶活与原始菌株相比约提高了40%。实验结果为完善甲基营养菌中类胡萝卜素的生物合成代谢途径提供了理论参考。

海洋甲基营养菌产吡咯喹啉醌(PQQ)的发酵条件优化及产物分离

从中国南海海泥中分离得到一株甲基营养菌ZJU414,能够用于生产辅酶PQQ。然后考察了4种碳源对其生长和产物合成的影响,结果表明甲醇作为其唯一碳源时PQQ产量最高。通过考察摇瓶装液量和优化甲醇浓度和甲醇补料方式,进一步提高PQQ产量,最高可达到1134μg/L。初步比较了7种不同阴离子交换树脂对PQQ的吸附和洗脱效率,发现树脂D316具有较高的吸附率和洗脱率,可以用于PQQ的离子交换分离,得率可达到86.5%。研究结果为进一步提高海洋甲基营养菌生产PQQ的工艺开发奠定了较好基础。