5-杂氮-2′-脱氧胞苷对宫颈癌细胞生长及其甲基化转移酶和甲基结合蛋白DNA转录的影响

目的:检测5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对体外培养的宫颈癌HeLa细胞中DNA甲基化转移酶(DNMT)及甲基CpG结合蛋白(MeCP)的DNA转录水平的影响,探索其对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法:5-Aza-CdR(终浓度为5.0μmol.L-1)与肿瘤细胞共培养72h后,用PI染色及流式细胞仪(FCM)检测肿瘤细胞的细胞周期;利用qRT-PCR鉴定药物组与空白组细胞DNMT及MeCP的mRNA浓度。吖啶橙(AO)细胞荧光染色法鉴定药物组与空白组细胞形态学上的差异及凋亡的程度。结果:FCM检测结果显示两组肿瘤细胞的细胞周期呈现明显差异,并且药物组细胞表现为G0/G1期阻滞,sub-G1峰明显。AO染色表明药物组细胞有明显凋亡迹象且伴随少量的细胞坏死现象。qRT-PCR结果显示,空白对照组和药物组中均有一定量DNMT及MeCP的mRNA产物,但其mRNA表达量无显著差异(P>0.05)。结论:5-Aza-CdR能够诱导体外培养的HeLa肿瘤细胞凋亡,而对于肿瘤细胞中甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的DNA转录无显著的影响。

DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞株CNE2的影响

目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2dC对人低分化鼻咽鳞癌细胞株CNE2的影响。方法应用10-7、10-6、10-5、10-4mol/L浓度的5-aza-2dC,处理人低分化鼻咽鳞癌细胞株CNE2 12、24、36、48、72 h后,应用MTT法测定CNE2细胞株的生存情况,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。用甲基化特异性PCR检测药物处理前后死亡相关蛋白激酶(DAPK)启动子甲基化状态。结果同一作用时间不同药物浓度组间,细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05),且作用72 h对人低分化鼻咽鳞癌细胞株CNE2生长抑制作用最强。流式细胞仪检测结果显示:10-4mol/L 5-aza-2dC诱导细胞凋亡最明显(P<0.01)。甲基化特异性PCR显示鼻咽癌细胞株中,5-aza-2dC可成功逆转DAPK基因启动子高甲基化状态。结论 5-aza-2dC对人低分化鼻咽鳞癌细胞株CNE2生长有抑制作用,且呈浓度和时间依赖性。

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对肝癌DNA甲基转移酶1及上皮钙黏附素表达的影响

目的：研究5-氮杂-2＇脱氧胞苷（5～Aza—CdR）对肝癌细胞中DNA甲基转移酶1（DNMT1）及上皮钙黏附素（E-cadherin）表达的影响。方法：免疫组织化学检测上皮钙黏附素在肝癌（26例）及癌旁组织（20例）中的表达。用终浓度10μmol／L的5-Aza-CdR处理培养的肝癌细胞株GQY-7703作为实验组，未处理细胞为对照组；DNMT1基因和上皮钙黏附素基因（CDH1）的转录产物及表达蛋白分别使用半定量RT-PCR和免疫印迹法检测；CDH1的甲基化状态使用甲基化特异性PCR（MSP）检测。结果：相比较癌旁组织，肝癌组织中上皮钙黏附素表达显著下调。5-Aza-CdR降低了GQY-7703细胞中DNMT1在转录水平和翻译水平的表达；CDH1CpG岛的甲基化水平降低；上皮钙黏附素mRNA和蛋白表达量明显增高，对电泳条带的半定量分析显示实验组和对照组之间的差异具有统计学意义。结论：5-Aza-CdR通过抑制DNMT1的表达，改变了CDH1基因的异常甲基化状态，进而恢复上皮钙黏附素的表达。

DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷的抗胃肠道肿瘤机制研究

目的 观察DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-2＇-deoxycytidine,5-Aza-CdR）对胃癌细胞生长的影响.方法 将野生型P53人胃癌细胞株AGS细胞,加入不同浓度的5-Aza-CdR,体外培养至不同时间.MTT法检测细胞增殖活性;平板细胞克隆形成实验检测细胞长期增殖活性（0 ～2.5 μM）;流式细胞仪检测细胞周期变化（25 μM,0、12、48、96 h）;Annexin V/PI双染实验检测细胞凋亡情况（2.5 μM,0、12、48、96 h）;比色法检测Caspase-3活力、Western blot检测Caspase-3前体蛋白及PARP（poly ADP-ribose polymerase,PARP）蛋白的含量（2.5 μM,0、12、48、96 h）.结果 随着5-Aza-CdR浓度增加,对肿瘤细胞的抑制作用亦增强,在50 μM作用72 h时,细胞存活率达最低值（31.9％）;随着药物处理时间的延长,胃癌AGS细胞凋亡增多,96 h的2.5μM 5-Aza-CdR作用下,细胞的生长抑制达到了最高峰（44.4％）,且其抑制作用表现为浓度和时间依赖性.5-Aza-CdR对肿瘤细胞长期生长有影响,克隆形成抑制率呈线性增加.流式细胞仪分析结果显示,随5-Aza-CdR作用时间延长,G2期细胞比例从0h的（5.7±0.2）％增加到96h的（28.5±0.2）％.随着药物作用时间的累加,其凋亡率逐渐增加,各时间组的细胞凋亡率与空白对照组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）.与空白对照组比较,Caspase-3活力在药物处理48、96 h后显著提高（P＜0.05）,但12 h AGS细胞的Caspase-3活力无变化;48 h Caspase-3前体比12h和未用5-Aza-CdR时明显减少,96 h减少最为明显;PARP在AGS细胞内经5-Aza-CdR作用48 h后亦被活化,96h后几乎检测不到PARP的存在.结论 5-氮杂-2＇-脱氧胞苷,能增强肿瘤细胞对化疗药的敏感性,可作为一种有效的抗胃肠道肿瘤药,.

miR-214-5p通过DNMT1介导的AXIN2基因DNA甲基化修饰在皮肤基底细胞癌中的作用机制

目的探讨皮肤基底细胞癌中轴抑制蛋白2(Axis inhibition protein 2,AXIN2)基因启动子甲基化对基因转录的影响及miR-214-5p通过靶向DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)对AXIN2甲基化率的调控机制。方法收集2022年1月-2023年6月在广州市皮肤病防治所就诊治疗的102例皮肤基底细胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma,BCC)患者作为研究对象,提取癌组织和癌旁正常组织标本及基线资料。焦磷酸测序法检测AXIN2基因启动子区甲基化率。实时荧光定量PCR检测AXIN2、DNMT1基因mRNA和miR-214-5p的表达水平。将miR-214-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其阴性对照(mimic NC和inhibitor NC)分别对基底细胞癌A431细胞进行转染,48 h后检测DNMT1基因mRNA表达水平和AXIN2基因甲基化率。结果BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率显著高于癌旁正常组织(t=5.128,P<0.001),AXIN2基因mRNA相对表达水平显著低于癌旁正常组织(t=7.826,P<0.001),DNMT1基因mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(t=4.838,P<0.001),miR-214-5p表达水平显著低于癌旁正常组织(t=5.426,P<0.001)。BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率与其mRNA表达水平呈负相关(r=-0.793,P<0.001),DNMT1基因mRNA水平与AXIN2基因甲基化率呈正相关(r=0.814,P<0.001),miR-214-5p表达水平与DNMT1基因mRNA水平呈负相关(r=-0.747,P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果证实,DNMT1是miR-214-5p的靶基因。细胞转染后,与mimic NC、inhibitor和inhibitor NC比较,mimic的DNMT1基因mRNA水平、AXIN2基因甲基化率显著降低(P<0.001);而inhibitor的DNMT1基因mRNA水平和AXIN2基因甲基化率相较于其他三组明显上升(P<0.001)。结论miR-214-5p可通过调控下游靶蛋白DNMT1表达,影响AXIN2基因的DNA甲基化率,调控AXIN2基因的表达水平,参与皮肤基底细胞癌的发生机制。

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对苯并[a]芘致海马神经元毒性的保护作用

目的探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-cdR)对苯并[a]芘(B[a]P)致海马神经元毒性的保护作用。方法体外培养海马神经元至第5天,观察并鉴定细胞。实验设立对照组,B[a]P组(20μmol/L B[a]P)和B[a]P+5-Aza-cdR组(20μmol/L B[a]P+10μmol/L 5-Aza-cdR)。观察细胞形态;检测细胞活力、DNA甲基转移酶蛋白和基因表达水平;测定细胞中的总甲基化水平和细胞凋亡情况。结果与对照组比较,B[a]P组海马神经元活性降低(P<0.05);细胞凋亡率升高(P<0.05);DNMT3A、DNMT3B基因和DNMT1、DNMT3A蛋白表达水平上升(P<0.05);总甲基化水平升高(P<0.05)。与B[a]P组比较,B[a]P+5-Aza-cdR组提高了海马神经元活性(P<0.05);降低细胞凋亡率(P<0.01);DNMTs基因和蛋白表达水平明显下降(P<0.05);总甲基化水平下降(P<0.01)。结论5-Aza-cdR对B[a]P诱导的海马神经元损伤有保护作用。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及DNA甲基化的影响

背景与目的:顺铂能造成细胞内DNA的损伤,而DNA错配修复蛋白能发现顺铂导致的DNA损伤,产生损伤信号,诱导细胞凋亡,从而摧毁肿瘤细胞。hMLH1是DNA错配修复系统的一个重要成员,其缺失能导致肿瘤对顺铂的耐受。本研究目的在于探讨卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及其基因启动子区DNA甲基化状态,同时探讨去甲基化制剂—5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'——deoxycytidine,5-Aza-dC)和组蛋白脱乙酰化酶抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对hMLH1表达及DNA甲基化的逆转作用。方法:应用5-Aza-dC和TSA作用于卵巢癌细胞COC1与其顺铂耐药细胞COC1/DDP,应用甲基化特异性PCR、RT-PCR和Western blot检测上述两种细胞中hMLH1基因启动子区DNA甲基化、hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的变化。MTT法检测药物对细胞增殖的影响。结果:COC1细胞存在hMLH1 mRNA和蛋白的表达,其启动子区域表现为DNA非甲基化。单独应用5-Aza-dC、TSA及联合应用5-Aza-dC和TSA对COC1细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05),细胞形态变化不明显。COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白表达缺失,启动子区域表现为DNA甲基化。5-Aza-dC不但能使COC1/DDP细胞中hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且能使表达缺失的hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白重新表达。TSA对COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05)。联合应用5-Aza-dC和TSA不但能使hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且与单独应用5-Aza-dC相比较,对hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的影响更明显(P<0.05)。5-Aza-dC单用及联合应用TSA对COC1/DDP细胞生长抑制率明显高于COC1组、阴性对照组(P<0.05)。结论:COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性与hMLH1mRNA和蛋白的表达缺失有关,而hMLH1基因和蛋白的表达缺失与其基因启动子区DNA甲基化相关,5-Aza-dC单用及联合TSA使hMLH1基因发生DNA去甲基化,促进hMLH1的表达,逆转COC1/DDP细胞对DDP的耐药性。

5杂-氮-2′-脱氧胞苷对顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞14-3-3σ基因甲基化的影响

目的观察5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞14-3-3σ基因甲基化的影响;探讨14-3-3σ基因甲基化与顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞耐药的关系。方法建立人胃癌顺铂耐药细胞株SGC-7901/CDDP,并用特异性甲基化抑制物5-Aza-CdR干预。MSP法检测14-3-3σ基因甲基化状态,蛋白质印迹法检测14-3-3σ蛋白表达,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期与凋亡。结果 SGC-7901/CDDP细胞的14-3-3σ基因高度甲基化并沉默,经过5、10μmol.L-15-Aza-CdR处理后,14-3-3σ蛋白重新表达,细胞发生顺铂耐药逆转,细胞活性抑制、在G0/G1期出现阻滞以及凋亡率明显增加。结论 5-Aza-CdR具有抑制顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞14-3-3σ基因甲基化的作用,同时,顺铂作用与耐药机制部分依赖于14-3-3σ基因。

5-杂氮脱氧胞苷逆转膀胱癌T24细胞死亡相关蛋白激酶的转录表达

目的研究膀胱癌细胞T24中死亡相关蛋白激酶(DAPK)启动子区的甲基化状态,探讨使用5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-dc)处理T24细胞后对DAPK转录表达的影响及其细胞生物学效应。方法使用不同浓度去甲基化药物5-aza-dc处理膀胱癌细胞株T24后,使用MTT法、流式细胞仪分别检测5-aza-dc对T24细胞的增殖抑制作用及凋亡率。应用甲基化特异性PCR(MSP)方法分别检测5-aza-dc(12.5μmol/L)处理前后T24细胞中DAPK启动子区甲基化状态的变化情况。应用RT-PCR、Western-blotting分别检测5-aza-dc(12.5μmol/L)处理前后T24细胞中DAPK转录、表达的变化情况。结果MTT法显示不同浓度5-aza-dc对T24细胞有明显的增殖抑制作用,流式细胞仪检测T24细胞的最大凋亡率为(24.12±1.4)%。正常培养条件下T24细胞中DAPK启动子区出现高甲基化且DAPKmRNA无表达,在5-aza-dc(12.5μmol/L)作用24h后,T24细胞中DAPK启动子区恢复为未甲基化状态且DAPKmRNA及蛋白重新恢复表达。结论膀胱癌细胞株T24中DAPK启动子区高甲基化可能是抑制其转录表达的重要原因;5-aza-dc可以通过去甲基化作用使DAPK恢复表达,从而抑制T24细胞的增殖并诱导细胞凋亡。5-aza-dc有望成为膀胱癌化疗的有效药物。

5-氮杂-2’-脱氧胞苷抑制肾癌细胞增殖及逆转γ-catenin基因甲基化作用

目的:研究甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肾癌OS-RC-2细胞生长的抑制作用及对γ-catenin基因甲基化状态的影响,初步探讨肾癌发病机制及临床治疗的可行性。方法:不同浓度5-Aza-CdR处理肾癌细胞OS-RC-2后,采用倒置显微镜观察5-Aza-CdR处理OS-RC-2肾癌细胞株前后细胞形态学变化;四唑蓝(MTT)比色观察细胞经药物处理前后的生长活性;流式细胞仪检测5-Aza-CdR对OS-RC-2肾癌细胞株凋亡的影响;Western blot检测5-Aza-CdR处理OS-RC-2肾癌细胞株后γ-catenin蛋白表达的变化;甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测细胞处理前后γ-catenin基因的甲基化状态。结果:形态学观察显示,用药后癌细胞体积缩小,核固缩,染色质凝聚成块;5-Aza-CdR明显抑制肾癌细胞OS-RC-2的生长;细胞凋亡率增高;药物处理后γ-catenin蛋白表达恢复;未经5-Aza-CdR处理的OS-RC-2细胞中γ-catenin基因启动子区域高甲基化,经10-5mol/L5-Aza-CdR处理72h后,γ-catenin基因启动子区域高甲基化得到逆转。结论:5-Aza-CdR能有效逆转肾癌OS-RC-2细胞γ-catenin基因的异常甲基化,恢复γ-catenin蛋白表达,诱导肾癌细胞凋亡。

5'-氮杂-2'-脱氧胞苷对结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因甲基化状态、mRNA表达及蛋白表达的影响

目的探讨甲基化酶抑制剂5'-氮杂-2'-脱氧胞苷(5'-Aza-CdR)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因甲基化水平、mRNA及蛋白表达的影响。方法用0.5、1.0、1.5μmol/L浓度的5'-Aza-CdR处理CRC细胞株HT-29和LoVo。应用MethyLight方法、实时荧光定量PCR方法及蛋白印迹试验(Westernblot)检测药物处理前后HT-29和LoVo细胞中MGMT基因的甲基化状态、mRNA和蛋白表达情况。结果 MethyLight检测HT-29和LoVo细胞中MGMT蛋白在药物作用后异常甲基化得到逆转。实时荧光定量PCR检测5'-Aza-CdR浓度为0.5、1.0、1.5μmol/L组HT-29细胞株和LoVo细胞株MGMT基因mRNA表达水平均较对照组上调,Western blot检测5'-Aza-CdR浓度为0.5、1.0、1.5μmol/L组MGMT蛋白表达水平均较对照组上调,且均具有药物剂量依赖性(P<0.05,P<0.01)。结论 CRC细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5'-Aza-CdR能够逆转CRC细胞株HT-29和LoVo中MGMT基因的甲基化状态,并能恢复mRNA及蛋白重新表达。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷联合曲古霉素 A 对高糖诱导下胰岛 β 细胞的增殖及 PDX-1 甲基化的影响

目的：探讨高糖诱导下应用5-氮杂-2~′-脱氧胞苷（5-Aza-d C）和曲古霉素A（TSA）对胰岛β细胞NIT-1细胞株增殖及PDX-1启动子区甲基化及其表达的影响。方法：胰岛β细胞株予33.3 mmol/L葡萄糖浓度处理后随机分为：空白对照（NC）组、高糖诱导（HG）组、5-Aza-d C干预组、TSA干预组、5-Aza-d C＋TSA联合干预组,检测细胞增殖情况、胰岛素释放水平、PDX-1启动子区甲基化状态及其表达水平的变化。结果：5-Aza-d C和TSA单独或联合干预可增加NIT-1细胞增殖率和胰岛素分泌量,降低PDX-1启动子区甲基化产物,增加PDX-1 m RNA相对表达量,并且联合组比单药组效果更加明显（均P〈0.05）。结论：5-Aza-d C和TSA可以激活高糖诱导下失表达的PDX-1,进而恢复胰岛β细胞功能,两药联合具有协同效应。

5-杂氮-2'脱氧胞苷对肝癌细胞SMMC-7721 miR-1247-5p基因表达及其启动子区甲基化的影响

目的观察正常人肝细胞系LO_2和肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p的表达,研究去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p表达及其基因启动子区Cp G岛甲基化水平的影响。方法用不同浓度(0、5和10μmol/L)去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷处理SMMC-7721细胞,用甲基化特异性PCR法检测miR-1247-5p基因启动子区甲基化水平;用SYBR Green qReal Time PCR法检测miR-1247-5p的表达。结果与正常人肝细胞系LO_2相比,肝癌细胞系SMMC-7721中miR-1247-5p表达降低(P<0.05)且其基因启动子区Cp G岛甲基化水平高;经去甲基化药物干预后miR-1247-5p的表达较对照组有明显上调(P<0.01),且其基因启动子区Cp G岛甲基化水平降低。结论 miR-1247-5p基因甲基化调控可能参与了肝癌的发生。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人胃癌SGC-7901细胞株生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响

目的:探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人胃癌细胞系SGC-7901细胞株的生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响.方法:使用1、2、5、10μmol/L5-Aza-CdR干预胃癌SGC-7901细胞,甲基化特异性PCR(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测药物干预前后EDNRB基因的甲基化状态和EDNRB mRNA的表达,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡的改变.结果:未经5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞中EDNRB基因启动子区域CpG岛高甲基化,且EDNRB mRNA不表达,经1、2、5、10μmol/L5-Aza-CdR处理4d后,EDNRB基因启动子区域高甲基化状态得到逆转,细胞中EDNRB mRNA表达恢复.4种浓度5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞后,细胞增殖受到抑制,且呈时间和剂量依赖性;并抑制SGC-7901细胞生长周期,其细胞周期阻滞于S期,5、10μmol/L5-Aza-CdR实验组细胞凋亡率显著高于对照组,且差异有统计学意义(7.13%±0.87%,13.34%±1.12% vs 3.69%±0.52%,P=0.032,P<0.001).结论:5-Aza-CdR能有效逆转人胃癌SGC-7901细胞EDNRB基因的异常甲基化,从而激活因高甲基化导致EDNRB基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,抑制该细胞的生长.

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对食管鳞癌ECa109细胞增殖及TIG1基因表达与甲基化状态的影响

目的:探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxy-cytidine,5-aza-CdR)对食管鳞癌细胞株ECa109增殖抑制作用,以及对ECa109中TIG1基因甲基化状态及其mRNA表达的影响。方法:实验组分别使用10、20、50、100μmol/L的5-aza-CdR处理ECa109细胞,对照组用不添加5-aza-CdR培养基培养;采用MTT法检测两组细胞生存率的变化;MSP检测TIG1基因的甲基化状态;RT-PCR法检测TIG1基因mRNA表达水平。结果:5-aza-CdR可以显著抑制ECa109的生长,实验组细胞生存率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。实验组同种药物浓度,作用时间延长,生存率显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);同一作用时间,随着药物浓度增加,细胞生存率降低,差异有统计学意义(P<0.01)。对照组ECa109细胞TIG1基因处于高甲基化状态,经过10μmol/L及20μmol/L的5-aza-CdR处理细胞株120h后,TIG1基因的甲基化部分解除。对照组ECa109细胞中无TIG1 mRNA表达,采用10μmol/L及20μmol/L浓度药物处理72、120、168h后细胞株中TIG1 mRNA恢复表达,且20μmol/L处理组细胞较10μmol/L组TIG1 mRNA表达增强。结论:5-aza-CdR可以抑制ECa109细胞生长,且具有剂量及时间依赖性;ECa109中TIG1基因甲基化阳性,其mRNA的表达缺失;经5-aza-CdR干预后可使TIG1基因发生去甲基化修饰,恢复表达,去甲基化修饰具有时间及剂量依赖效应。

5-杂氮-2’-脱氧胞苷和5-氟尿嘧啶对食管癌细胞系中E-Cadherin和TIMP3基因甲基化状态及蛋白表达的影响

目的:观察去甲基化药物5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和5-氟尿嘧啶(5-FU)对食管癌细胞系EC1和EC9706(均存在E-Cadherin甲基化改变和TIMP3基因未发生甲基化改变)中2种基因甲基化状态及蛋白表达的影响。方法:用5-Aza-CdR和5-FU分别作用于EC1和EC9706细胞,应用甲基化特异性PCR检测2种药物处理前后细胞中E-Cadherin基因和TIMP3基因的甲基化状态,应用免疫细胞化学方法检测TIMP3和E-Cadherin蛋白的表达。结果:5-Aza-CdR或5-FU处理后两种食管癌细胞系中TIMP3基因仍为非甲基化;5-Aza-CdR作用后,两种食管癌细胞系中E-Cadherin基因的甲基化状态发生了逆转,而5-FU作用后,E-Cadherin基因的甲基化状态无改变。EC1和EC9706经5-Aza-CdR处理后TIMP3蛋白表达无改变,而经5-FU处理后表达增强(P<0.05),EC1和EC9706经两种药物处理后E-Cadherin蛋白表达均增强(F=116.835、119.628、191.700和210.532,P<0.001)。结论:5-Aza-CdR能够有效逆转EC1和EC9706细胞中E-Cadherin基因甲基化状态,并使其蛋白恢复表达;对TIMP3基因的甲基化状态和蛋白表达影响不大。

5-杂氮-2′-脱氧胞苷对鼻咽癌细胞株细胞周期及14-3-3σ基因甲基化的影响

目的探讨5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-2dC)对鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、5-8F、6-10B增殖、凋亡和细胞周期分布的影响,并进一步分析5-aza-2dC处理对14-3-3σ基因甲基化状态的影响。方法用不同浓度5-aza-2dC处理鼻咽癌细胞,MTT实验观察细胞生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡比例,用甲基化特异性PCR(MSP)分析14-3-3σ基因甲基化状态。结果5-aza-2dC对4株细胞均有生长抑制作用,CNE1和6-10B细胞对药物敏感性高于CNE2和5-8F。5-aza-2dC处理使4株细胞凋亡率出现剂量依赖性的增加,CNE1和6-10B细胞对药物敏感性高于CNE2和5-8F。经5-aza-2dC处理后,CNE1、CNE2、6-10B细胞出现不同程度的G0/G1期阻滞,而5-8F表现为G0/G1期和G2/M期双期阻滞。不经5-aza-2dC处理情况下4株细胞14-3-3σ基因均存在不同程度的甲基化,5-aza-2dC处理能够使14-3-3σ基因去甲基化。结论5-aza-2dC具有抗鼻咽癌作用,抑制作用强弱可能与鼻咽癌分化程度和转移潜能有一定关系,其机制可能与使14-3-3σ等抑瘤基因去甲基化有关。

5’-氮杂-2’-脱氧胞苷对HT-29和LoVo结直肠癌细胞株中Runx3基因甲基化状态、mRNA表达及蛋白表达的影响

目的探讨甲基化酶抑制剂5’-氮杂-2’-脱氧胞苷(5’-Aza-2’-deoxycytidine,5’-Aza-CdR)对结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Runx3基因甲基化水平、mRNA及蛋白表达的影响。方法用不同浓度5’-Aza-CdR处理结直肠癌细胞株HT-29和LoVo。应用TaqMan探针为基础的实时定量PCR(Methylight)方法、SYBR Green PCR方法及蛋白印迹实验(Western blot)检测药物处理前后HT-29和LoVo细胞中Runx3基因的甲基化状态、mRNA和蛋白表达。结果 TaqMan探针为基础的实时定量PCR法检测HT-29和LoVo细胞中Runx3蛋白在药物作用后异常甲基化得到逆转;实时荧光定量PCR和Western Blot检测到0.5,1.0,1.5μM 5’-Aza-CdR处理后Runx3基因mRNA和蛋白均重新表达,具有统计学意义(P均<0.05)。结论结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Runx3启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5’-Aza-CdR能够较成功的逆转结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Runx3基因的甲基化状态,并能恢复mRNA及蛋白重新表达。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因甲基化及其表达的影响

目的观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对体外培养的肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因启动子区DNA甲基化状态及其表达的影响,探讨肺癌细胞p16、MGMT基因失活的机制及去甲基化制剂对p16、MGMT基因表达的调控。方法 5-Aza-CdR处理体外培养的肺癌SPC-A-1细胞,甲基化特异性PCR(MSP)法检测用药前后细胞p16、MGMT基因的甲基化状态,RT-PCR法检测用药前后细胞p16、MGMT mRNA。结果加入5-Aza-CdR前,SPC-A-1细胞p16、MGMTmRNA表达缺失,其启动子区域表现为DNA甲基化。加入5-Aza-CdR后,SPC-A-1细胞中p16、MGMT基因呈现DNA去甲基化,而且表达缺失的p16、MGMT mRNA重新表达。结论启动子区高甲基化是肺癌细胞p16、MGMT基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR能逆转p16、MGMT基因甲基化状态,从而调控p16、MGMT基因表达。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷诱导胃癌细胞系中p16和MGMT基因去甲基化并激活其表达

目的观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对体外培养的胃癌细胞MGC-803中p16和MGMT基因启动子区DNA甲基化状态及表达的影响,探讨胃癌细胞p16和MGMT基因失活的机制及去甲基化制剂对p16和MGMT基因表达的调控。方法5-Aza-dC处理体外培养的胃癌细胞MGC-803后,甲基化特异性PCR(MSP)法检测用药前后细胞中p16和MGMT基因的甲基化状态,RT-PCR法检测用药前后细胞中p16和MGMTmRNA表达的变化。结果胃癌细胞系MGC-803中p16和MGMTmRNA表达缺失,其启动子区域表现为DNA甲基化。5-Aza-dC不但能使MGC-803细胞中p16和MGMT基因发生DNA去甲基化,而且能使表达缺失的p16和MGMTmRNA重新表达。结论启动子区高甲基化是胃癌细胞p16和MGMT基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂-5-Aza-dC能逆转p16和MGMT基因甲基化状态,从而调控p16和MGMT基因表达。