甲基CpG结合域四聚体蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的在大肠埃希菌中表达甲基CpG结合域四聚体蛋白,并对其进行纯化和鉴定。方法将重组表达质粒4×MBD-pET30b+转化大肠埃希菌DH5a克隆扩增并测序鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3)后接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达,用此蛋白免疫染色人胚肾细胞后用荧光显微镜观察。结果克隆质粒测序结果与理论预期完全一致,SDS-PAGE显示在大肠埃希菌中表达出相对分子量为46000的目标蛋白,Western blot显示目标蛋白带有His融合标签(氨基端)和HA标签(羧基端)。荧光显微镜观察显示MBD蛋白能与细胞内的甲基化CpG基序特异性结合。结论成功表达并纯化了具有免疫原性的甲基CpG结合域四聚体蛋白,为今后进一步研究DNA甲基化奠定了基础。

甲基化CpG结合域蛋白1在胰腺癌组织中的表达和意义

目的:检测甲基化CpG结合域蛋白1(MBD1)蛋白在胰腺癌组织中的表达,并探讨其临床意义。方法:应用S-P免疫组织化学法检测38例胰腺癌、17例胰腺癌旁组织、8例胰腺良性肿瘤、3例慢性胰腺炎和6例正常胰腺组织中MBD1蛋白的表达。结果:MBD1在胰腺癌组织、正常胰腺组织、胰腺良性肿瘤、胰腺癌旁组织中的表达阳性率分别是76.32%(29/38)、16.67%(1/6)、25.0%(2/8)、29.41%(5/17),3例慢性胰腺炎标本中未见表达;胰腺癌阳性表达率明显高于正常胰腺、慢性炎症、良性肿瘤和癌旁对照组织(P<0.05)。MBD1表达水平的高低与病人的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度和TNM分期无显著性差异(P>0.05);而与淋巴结转移密切相关,有淋巴结转移者胰腺癌组织MBD1的表达阳性率为92.31%(24/26),高于无淋巴结转移者的41.67%(5/12)(P<0.01)。结论:胰腺癌中MBD1呈高水平表达,并与胰腺癌的高转移侵袭活性有关,其机制可能与MBD1介导抑制多个甲基化相关抑癌基因的表达有关。MBD1的转录调控机制有待进一步研究。

甲基化CpG结合域重组蛋白的表达与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达甲基化CpG结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD)重组蛋白。方法:对人甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,Mecp2)的MBD区行密码子优化,将人工合成的DNA克隆至原核表达载体pGS21a,在大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)中诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达;镍亲和层析柱纯化重组蛋白。表面等离子共振分析重组MBD蛋白与甲基化DNA的结合能力。结果:酶切和核酸测序证实,成功构建了含密码子优化的MBD基因的原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot结果显示,MBD重组蛋白在大肠杆菌中得到表达。亲和层析法纯化后获得了相对分子量为38 000的MBD重组蛋白。SPR分析显示MBD重组蛋白能特异结合甲基化DNA。结论:成功构建含密码子优化的MBD基因的原核表达载体,MBD重组蛋白能在大肠杆菌中表达。

甲基化CpG结合域蛋白1和VIMENTIN在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的探讨甲基化CpG结合域蛋白1(MBD1)和VIMENTIN蛋白在胰腺癌组织中的表达情况及其与胰腺癌临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学方法检测40例经手术切除的胰腺癌组织和10例良性肿瘤患者的正常胰腺组织中MBD1和VIMENTIN蛋白的表达。结果在40例胰腺癌标本中有28例(70.0%)MBD1呈阳性表达,16例(40.0%)VIMENTIN蛋白呈阳性表达,显著高于正常胰腺组织标本的1例(1/10)和0例(P值均<0.05)。MBD1与VIMENTIN蛋白的阳性表达呈正相关(r=0.423,P=0.012)。在有淋巴结转移的胰腺癌中的MBD1表达阳性率显著高于无淋巴结转移的胰腺癌(P=0.023)。在病理分化较差和有淋巴结转移的胰腺癌中的VIMENTIN表达阳性率显著高于病理分化较好及无淋巴结转移的胰腺癌(P值分别=0.027、0.003)。结论胰腺癌组织中存在MBD1和VIMENTIN的过表达,并与病理分级和淋巴结转移有关,MBD1可能通过调控甲基化过程,干预VIMENTIN的表达,在胰腺癌的发生、发展中起到重要作用。

小鼠围着床期子宫内膜甲基化CpG结合域蛋白2的表达规律

为研究甲基化CpG结合域蛋白2(methyl-CpG binding domain protein 2,MBD2)在围植入期小鼠子宫内膜的表达规律,通过采用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)、Western blot和免疫组化技术检测未孕小鼠(d0)和不同孕天小鼠子宫MBD2的表达情况。qPCR结果显示,d0至d7的小鼠子宫内膜组织均有MBD2 mRNA表达,在d5至d7高表达。MBD2蛋白在子宫内膜的表达规律与qPCR结果相符。MBD2蛋白在孕d1到d4中度表达于腔上皮、腺上皮和基质细胞,在d5至d7基质细胞表达增强,主要表达于蜕膜区。假孕小鼠子宫内膜中,MBD2在腔上皮、腺上皮和基质细胞中中度表达,d5至d7基质细胞表达明显减弱。动物模型中,宫角注射MBD2基因反义寡聚脱氧核苷酸,可抑制MBD2的表达,降低人工诱导蜕膜化反应和蜕膜化标志物PRL的表达。MBD2在早孕小鼠子宫内膜的表达模式提示其可能参与了蜕膜化过程。

MBD2在老年胃癌中的表达及其对胃癌细胞多药耐药性的作用

目的探讨甲基化CpG结合域蛋白质2(MBD2)在老年胃癌中的表达及其对胃癌细胞多药耐药性的作用。方法采用免疫组化染色法检测70份老年胃癌组织及其相应的癌旁组织标本中的MBD2表达情况,并分析其表达水平与病理参数的关系。Western印迹检测MBD2在胃癌细胞系SCG7901及其耐药细胞系中的表达。使用MBD2的小干扰RNA静默MBD2表达后,通过MTT试验检测化疗药物顺铂、5-氟尿嘧啶对胃癌细胞的半数抑制浓度(IC50)。结果 MBD2在胃癌组织中阳性表达率为72.86%,明显低于相应的癌旁组织中的92.86%(P<0.01)。MBD2在胃癌组织中表达与TNM分期、远处转移相关;其中MBD2在TNM分期为Ⅰ期和Ⅱ期的患者中阳性表达率明显高于Ⅲ期和Ⅳ期患者(P<0.05)。SGC7901/阿霉素、GC7901/长春新碱中的MBD2/β-actin灰度比值明显低于其亲本细胞SGC7901(P<0.01)。SGC7901细胞和转染无关序列对照寡核苷酸的SGC7901细胞MBD2/β-actin比值之间差异无统计学意义(P>0.05);转染MBD2特异性小干扰RNA的SGC7901细胞中MBD2/β-actin比值明显低于上述两株对照组细胞(P<0.05)。转染MBD2特异性小干扰RNA的胃癌细胞对顺铂和5-氟尿嘧啶的IC50值均明显高于转染无关序列对照寡核苷酸的胃癌细胞(P<0.01)。结论 MBD2在老年胃癌组织中表达明显降低,与临床分期和远处转移有关,可抑制胃癌细胞的多药耐药性,说明MBD2表达失调参与了胃癌的发生、发展。

MeCP2和TNC在子宫肌瘤组织中的表达水平及其临床意义

【目的】探讨甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)和肌腱蛋白C(TNC)在子宫肌瘤组织中的表达水平及其临床意义。【方法】选取2019年1月至2021年9月陕西省康复医院收治的109例子宫肌瘤患者为观察组,另选取68例同期因子宫脱垂行子宫切除术患者为对照组。收集两组患者基本资料,采取免疫组化法检测观察组子宫肌瘤组织、子宫肌瘤旁组织及对照组子宫平滑肌组织中MeCP2和TNC蛋白表达情况。分析子宫肌瘤患者子宫肌瘤组织及瘤旁组织中MeCP2和TNC蛋白表达情况,分析子宫肌瘤发生的影响因素,分析观察组MeCP2和TNC水平与子宫肌瘤直径关系。【结果】子宫肌瘤组织中MeCP2、TNC阳性表达率均高于子宫肌瘤旁组织(P<0.05)。Logistic多因素回归分析结果显示月经紊乱(OR:3.892,95%CI:1.576~9.611)、流产次数(OR:4.293,95%CI:1.739~10.601)、MeCP2阳性(OR:4.495,95%CI:2.218~9.110)、TNC阳性表达(OR:4.341,95%CI:2.142~8.796)是子宫肌瘤发生的影响因素(P<0.05)。子宫肌瘤≥5 cm患者MeCP2、TNC阳性表达率均高于子宫肌瘤<5 cm患者(P<0.05)。【结论】子宫肌瘤发生与子宫平滑肌组织中MeCP2、TNC表达有关,且其表达水平可能与子宫肌瘤直径相关。

miR-519d-3p通过靶向MECP2抑制口腔鳞状细胞癌增殖、迁移与侵袭的研究

目的探究miR-519d-3p与甲基化CpG结合蛋白2(MECP2)的作用关系及其对口腔鳞状细胞癌(OSCC)的影响。方法逆转录PCR(RT-PCR)筛选最适细胞进行后续实验。分组转染miR-519d-3p或MECP2重组表达载体,双荧光素酶报告基因实验检测靶向作用关系,CCK8检测细胞增殖倍数,流式细胞术检测细胞周期阻滞及细胞凋亡,划痕愈合法检测细胞迁移,Transwell法检测细胞侵袭,Western blot检测MECP2、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、周期蛋白D1(Cyclin D1)、活化型半胱天冬酶3(cl-CASP3)和分泌性卷曲相关蛋白4(SFRP4)蛋白水平,MSP法检测SFRP4甲基化水平。结果与癌旁组织比较,在OSCC组织标本中miR-519d-3p表达水平降低,MECP2基因表达水平升高,miR-519d-3p和MECP2存在靶向作用关系(P<0.05)。与mimics NC组比较,miR-519d-3p mimics组OSCC细胞增殖倍数降低,细胞周期阻滞,细胞凋亡率升高,细胞迁移和侵袭能力降低,MECP2、MMP-2、Cyclin D1蛋白水平降低,E-cadherin、cl-CASP3、SFRP4蛋白水平升高,SFRP4基因去甲基化;MECP2蛋白水平提高可扭转miR-519-3p mimics引起的上述各指标的变化。结论miR-519d-3p可靶向作用于MECP2,抑制OSCC细胞的增殖、迁移与侵袭。