急性脑梗死患者静脉溶栓前后闭锁蛋白、甲基CpG结合蛋白2、钙调蛋白表达与功能结局的关系

目的:分析急性脑梗死(ACI)患者静脉溶栓前后闭锁蛋白(Occludin)、甲基CpG结合蛋白2(MECP2)、钙调蛋白(CAM)表达与功能结局的关系。方法:选取2020年1月-2022年1月我院收治的ACI患者134例作为ACI组,同期进行健康体检的健康志愿者50例作为NC组。使用酶标仪测定Occludin、MECP2、CAM水平,在ACI患者静脉溶栓后90d时,使用日常生活活动能力量表评价功能结局,根据ACI患者静脉溶栓后功能结局分为结局不良组、结局良好组两个亚组。分析ACI患者静脉溶栓前后Occludin、MECP2、CAM表达变化及与功能结局的关系。结果:ACI组Occludin水平低于NC组,MECP2、CAM水平高于NC组,差异具有统计学意义(P<0.05)。ACI患者溶栓后90d Occludin水平高于溶栓前,MECP2、CAM水平低于溶栓前,差异具有统计学意义(P<0.05)。结局不良组Occludin水平低于结局良好组,MECP2、CAM水平高于结局良好组,差异具有统计学意义(P<0.05)。由Pearson相关性分析发现,Occludin、MECP2、CAM与ACI患者静脉溶栓后功能结局相关(均P<0.05)。ROC曲线显示,相比于Occludin、MECP2、CAM单项预测,三项联合预测效能最佳,三项联合预测的AUC为0.912(95%CI=0.828~1.036),敏感度为89.00%,特异度为81.50%,P<0.001。结论:ACI患者Occludin水平降低,MECP2、CAM水平升高,静脉溶栓可改善Occludin、MECP2、CAM水平,而溶栓功能结局不良与Occludin、MECP2、CAM异常有关。

甲基CpG结合蛋白2与Rett综合征

DNA甲基化转录抑制的机制之一是通过在甲基化 DNA上结合上特异的转录抑制因子 (repressors)发挥作用的 ,这种转录抑制因子即为甲基 Cp G结合蛋白 (Me CP)。现已发现了多种甲基 Cp G结合蛋白 ,如 Me CP1和 Me CP2等 ,本文主要介绍 Me CP2的研究状况及与

甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)基因多态性与长江以南汉族人群系统性红斑狼疮(SLE)的相关性

目的探讨甲基CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)基因单核苷酸多态性与中国长江以南汉族人群系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的易感性。方法采用病例对照研究设计,收集病例141例,对照144例。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对rs2239464、rs2075596两位点进行基因分型,在不同的遗传模式下分析两个位点基因多态性与SLE的相关性。根据赤池信息准则(Akaike’s information criteria,AIC)值最小原则,筛选最优模型。结果在显性、隐性、相加及相乘遗传模式下,两位点基因型或等位基因频率分布在病例组与对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。显性遗传模式下,rs2239464、rs2075596位点GG/AG基因型为SLE的保护性基因型(ORrs2239464=0.528,95%CIrs2239464:0.315～0.885;ORrs2075596=0.435,95%CIrs2075596:0.264～0.717)。隐性遗传模式下,rs2239464、rs2075596位点GG基因型在统计学上具有显著的保护性作用(ORrs2239464=0.108,95%CIrs2239464:0.013～0.863;ORrs2075596=0.097,95%CIrs2075596:0.012～0.771)。相加遗传模式下,以AA基因型为参照,rs2239464位点GG基因型为SLE的保护性基因型(OR=0.094,95%CI:0.012～0.758),rs2075596位点AG及GG基因型也具有保护性作用(ORAG=0.498,95%CIAG:0.298～0.832;ORGG=0.077,95%CIGG:0.010～0.612)。相乘遗传模式下,rs2239464、rs2075596两位点的G等位基因为SLE的保护性等位基因(ORrs2239464=0.503,95%CIrs2239464:0.319～0.793;ORrs2075596=0.445,95%CIrs2075596:0.289～0.686)。rs2239464,rs2075596位点的最优遗传模式均为相加遗传模式。结论在中国长江以南汉族人群中MECP2基因rs2239464,rs2075596位点基因多态性与SLE相关,突变等位基因G可能是SLE保护性等位基因。

电磁脉冲辐照促进大鼠海马组织甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)表达并下调神经源素2(Ngn2)的表达

目的研究电磁脉冲(EMP)辐照后海马神经元形态、大鼠海马神经源素2(Ngn2)和甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)蛋白表达水平的改变。方法成年健康雄性SD大鼠随机分为对照组、EMP 7 d组、EMP 14 d组(n=12)。采用HE染色检测大鼠海马神经元的形态、Western blot法检测大鼠海马神经元Ngn2、MeCP2、脑源性神经营养因子(BDNF)、突触后致密蛋白95(PSD95)的蛋白水平,免疫荧光组织化学染色检测大鼠海马神经元MeCP2、Ngn2的表达。结果与对照组比较,EMP 7 d组和EMP 14 d组锥体细胞减少,神经元边界模糊,细胞核轮廓模糊不清。与EMP 7 d组相比,EMP 14 d组海马神经元结构破坏更严重;与对照组比较,EMP 14 d组和EMP 7 d组Ngn2、BDNF、PSD95含量降低,而MeCP2表达增加。结论EMP暴露导致大鼠海马组织神经元病理损伤,MeCP2表达增加,Ngn2、PSD95、BDNF表达降低。

甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)遏制HEK293细胞甲基化修饰的IL-6启动子活性及其分子机制

目的 在HEK293细胞甲基化修饰白细胞介素6(IL-6)启动子序列并过表达甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)以及转录因子P300,探讨MeCP2抑制IL-6转录活性的分子机制。方法 通过电泳迁移率实验(EMSA)对P300 IL-6启动子区域的P300结合位点进行验证,IL-6启动子序列连接于荧光素酶报告质粒并转染HEK293细胞,同时利用规律间隔的成簇短回文重复序列-去活性Cas9核酸酶-DNA甲基转移酶3A(CRISPR-dCas9-DNMT3A)转染介导启动子的甲基化修饰,再转染MeCP2以及P300过表达质粒。亚硫酸氢盐测序PCR分析各组IL-6启动子区域胞嘧啶甲基化修饰情况;Western blot法检测胞内MeCP2、 P300蛋白水平;通过化学发光检测仪测定HEK293荧光素酶活性,并结合染色质免疫沉淀-测序技术(ChIP-seq)分析各组P300以及MeCP2在IL-6启动子区域的结合水平。结果 EMSA证实小鼠IL-6启动子部位存在P300结合位点;CRISPR-dCas9-DNMT3A转染HEK293细胞能够成功甲基化小鼠IL-6启动子;MeCP2以及P300过表达质粒能够稳定合成目标蛋白,且不受其他转染影响。相比于未被修饰的启动子,甲基化修饰可降低启动子转录活性,且于P300过表达情况下,较之单纯甲基化修饰,过表达MeCP2还将进一步遏制启动子转录活性。此外,甲基化修饰的启动子与MeCP2结合后,过表达P300未提升启动子转录活性;而在其他转染条件下,过表达P300均能促进转录活性。Chip-seq分析进一步表明,启动子的甲基化修饰并不干扰P300结合;然而甲基化修饰的启动子与MeCP2结合后,P300与启动子的结合则受到抑制。结论 MeCP2与甲基化修饰的IL-6启动子相结合,可阻遏转录因子与启动子结合,从而进一步抑制启动子的转录活性。

血清胶质纤维酸性蛋白、甲基化CpG结合蛋白2对脑胶质瘤的诊断价值及其与病理特征的相关性分析

目的探讨血清胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)对脑胶质瘤的诊断价值及其与病理特征的相关性。方法回顾性选取2021年1月至2024年1月南京医科大学附属脑科医院(南京脑科医院)收治的80例脑胶质瘤患者,将其作为胶质瘤组,选取本院同期收治的80例非胶质瘤颅内良性肿瘤患者作为对照组。应用双抗体夹心法检测两组患者血清GFAP表达水平,应用荧光定量聚合酶链反应法检测肿瘤组织MeCP2表达水平。比较脑胶质瘤患者与对照组的GFAP、MeCP2表达水平,并建立ROC曲线分析GFAP、MeCP2对脑胶质瘤的诊断价值。分析不同病理特征脑胶质瘤患者GFAP、MeCP2表达水平,并采用Spearman相关性分析GFAP、MeCP2与脑胶质瘤病理特征的相关性。结果胶质瘤组患者GFAP、MeCP2表达水平分别为(81.74±7.47)ng/L、2.31±0.31,均高于对照组[(5.35±1.32)ng/L、0.72±0.16],差异均有统计学意义(P<0.05)。绘制ROC曲线结果显示,GFAP、MeCP2、两者联合诊断脑胶质瘤的曲线下面积(AUC)分别为0.721、0.698、0.897。GFAP、MeCP2两者联合对脑胶质瘤的诊断AUC高于两者单一诊断。病理分级Ⅳ级、远处转移患者GFAP水平均高于其他分级、未远处转移,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理分级Ⅳ级、肿瘤大小≥3 cm、远处转移患者MeCP2水平均高于其他分级、肿瘤大小<3 cm、未远处转移患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关分析结果表明,GFAP与脑胶质瘤不同病理分级、远处转移均呈正相关(r=0.579、0.378,P<0.05);MeCP2与脑胶质瘤不同病理分级、远处转移、脑胶质瘤肿瘤大小均呈正相关(r=0.657、0.457、0.384,P<0.05)。结论胶质纤维酸性蛋白、甲基化CpG结合蛋白2对于脑胶质瘤均具有重要诊断参考价值,两者联合诊断敏感度、特异度更高,且两者与脑胶质瘤的病理分级、肿瘤大小、远处转移情况密切相关。

人精子DNA从头甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的mRNA表达分析

目的通过体外分离成熟的精子,利用实时荧光定量PCR(qRealTime-PCR)检测其是否表达DNA从头甲基化转移酶(DNMT1/3a/3b)及甲基CpG结合蛋白(MeCP2),为精子中甲基化表观修饰研究提供依据。方法体外采集健康男性志愿者的精液标本,利用精子上游收集法获得具有活性的成熟精子。通过SYBR Green/PI双染色法,利用流式细胞术(FCM)检测精子样本的质膜完好性及其活性。抽提精子的总RNA,逆转录PCR获得cDNA,利用qRealTime-PCR鉴定精子甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的mRNA表达情况。结果SYBR Green/PI双染色和流式细胞仪检测发现,利用上游收集法可以收集SYBR Green+/PI-的精子占总精子数的(94.513±1.120)%,表明该方法可以收集到质膜完好且活性强的精子。qRealTime-PCR结果显示,此样本精子中DNA从头甲基化转移酶的表达比较明显,而甲基CpG结合蛋白的表达量相当低。其中DNMT1的mRNA表达量较高(0.272±0.045,P<0.05),DNMT3a和DNMT3b的表达水平比较弱[(4.930±0.01)E-006,(6.500±1.7)E-005,P<0.05],而MeCP2几乎不表达([2.12±0.91)E-006,P<0.05]。结论利用qRealTime-PCR可以比较快速方便的检测出此次精子样本中DNA从头甲基化转移酶和甲基CpG结合蛋白的mRNA表达水平。

DNA甲基转移酶与甲基化CpG结合结构蛋白2在胃肠间质瘤的表达

目的研究DNA甲基转移酶(DNMT)和甲基化CpG结合结构蛋白2(MBD2)在胃肠道间质瘤(GIST)的蛋白表达。方法采用免疫组织化学法与免疫印迹法对28例成人GIST标本及配对对照标本进行DNMTs与MBD2的蛋白表达研究。结果 DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3L、MBD2蛋白在GIST中表达显著高于配对对照组织,差异有统计学意义(P<0.05),但DNMT3a在GIST的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 GIST表达DNMTs(除外DNMT3a)和MBD2更显著。

甲基CpG结合蛋白对基因转录的调控

甲基 Cp G结合蛋白 (Me CPs)有 5个成员 (Me CP1、Me CP2、MBD1、MBD3和 MBD4 ) ,通过特异结合于甲基化 Cp G位点 (m Cp G)而抑制基因表达。目前研究较清楚的是 Me CP1、Me CP2和 MBD1。Me CP1可与至少 1 2个对称的 m Cp G结合 ,Me CP2和 MBD1均与单一的 m Cp G位点结合。Me CP1和 Me CP2可干扰非甲基化敏感的转录因子 Sp1与启动子区的结合 ,也可与组蛋白脱乙酰酶 (HDAC)形成复合物 ,影响局部组蛋白乙酰化状态。HDAC抑制剂 TSA可解除 MBD1对报告基因的抑制 ,提示

甲基化CpG结合域蛋白1在胰腺癌组织中的表达和意义

目的:检测甲基化CpG结合域蛋白1(MBD1)蛋白在胰腺癌组织中的表达,并探讨其临床意义。方法:应用S-P免疫组织化学法检测38例胰腺癌、17例胰腺癌旁组织、8例胰腺良性肿瘤、3例慢性胰腺炎和6例正常胰腺组织中MBD1蛋白的表达。结果:MBD1在胰腺癌组织、正常胰腺组织、胰腺良性肿瘤、胰腺癌旁组织中的表达阳性率分别是76.32%(29/38)、16.67%(1/6)、25.0%(2/8)、29.41%(5/17),3例慢性胰腺炎标本中未见表达;胰腺癌阳性表达率明显高于正常胰腺、慢性炎症、良性肿瘤和癌旁对照组织(P<0.05)。MBD1表达水平的高低与病人的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度和TNM分期无显著性差异(P>0.05);而与淋巴结转移密切相关,有淋巴结转移者胰腺癌组织MBD1的表达阳性率为92.31%(24/26),高于无淋巴结转移者的41.67%(5/12)(P<0.01)。结论:胰腺癌中MBD1呈高水平表达,并与胰腺癌的高转移侵袭活性有关,其机制可能与MBD1介导抑制多个甲基化相关抑癌基因的表达有关。MBD1的转录调控机制有待进一步研究。

甲基化CpG结合蛋白家族(MeCPs)在表遗传中的作用

表遗传学(epigenetics)主要研究基因型和表型之间的关系。基因组表遗传修饰主要包括遗传物质DNA的甲基化修饰和核小体组蛋白修饰,最终结果是DNA碱基不发生改变的情况下而表型却发生了变化。甲基化CpG结合蛋白家族(methyl-GpGbindingproteins,MeCPs)是能与甲基化CpG二核苷酸结合的一类核蛋白,从而有机地将DNA甲基化和组蛋白修饰耦合起来,在表遗传中发挥着中枢纽带的作用。本文简述了近年来表遗传中DNA甲基化和组蛋白修饰的最新研究进展以及MeCPs家族在表遗传中的重要作用,目的是使人们进一步了解表遗传作用规律。

微小RNA-373在肝门部胆管癌细胞中的达和靶向甲基CpG结合蛋白2的作用

目的 分析微小RNA（miR）-373在肝门部胆管癌的表达与临床病理因子之间的关系,探讨miR-373靶向甲基CpG结合蛋白2（MBD2）-3’端非翻译区（3＇ UTR）的机制.方法 TaqMan miRNA Assay检测miR-373的表达,采用QuantiTect_Primer Assays和Western blot法分析甲基CpG结合蛋白（MBPs） mRNA和蛋白水平；双荧光素酶报告基因检测miR-373对MBD2-3＇ UTR的靶向作用.结果 miR-373在肝门部胆管癌中上调2.94倍（P＜0.01）.与高表达组比较,miR-373低表达与肿瘤细胞低分化（P＜0.05）、高分期（P＜0.05）、短总生存和无病生存时间（P＜0.05）相关.miR-373低表达肿瘤组织中,MBD2的mRNA和蛋白表达分别上调3.75倍（P＜0.01）、2.34倍（P＜0.05）；miR-373前体抑制MBD2-3＇ UTR荧光素酶活性1.79倍；外源性miR-373和anti-miR-373分别下调QBC939细胞、上调人肝内胆管上皮细胞（HIBEpic）中MBD2表达2.56倍（P＜0.01）和2.13倍（P＜0.01）.结论 miR-373通过结合在MBD2-3＇ UTR,抑制MBD2表达.肝门部胆管癌中,miR-373下调导致MBD2表达增高,与肿瘤进展和预后密切相关.

甲基化CpG结合结构蛋白2在胃癌的表达及靶向抑制

目的:研究甲基化CpG结合结构蛋白2(methyl-CpG-binding domain protein 2,MBD2)在胃癌的表达及靶向抑制。方法:免疫组化法对40例胃癌及配对胃黏膜组织,免疫荧光法对胃癌细胞SGC-7901行MBD2表达研究。构建3个靶向抑制MBD2的siRNA(MBD2-siRNA-1、MBD2-siRNA-2、MBD2-siRNA-3)。转染MBD2-siRNA入SGC-7901,RT-PCR及Western blot验证MBD2的抑制效果。噻唑蓝比色法检测SGC-7901增殖率。结果:胃癌组织MBD2表达较对照胃黏膜组织增强(χ2=6.646,P=0.010);且低分化胃癌与伴幽门螺杆菌感染的胃癌中MBD2表达更强(χ2值分别为9.730、8.700,P值分别为0.01和0.04)。MBD2蛋白在胃癌胞核分布。MBD2-siRNA可成功转染SGC-7901,并成功筛选靶向抑制MBD2的siRNA(MBD2-siRNA-2)。发现转染MBD2-siRNA-2后96 h,SGC-7901增值率被抑制。结论:MBD2在胃癌表达增强,抑制MBD2可能抑制胃癌增殖。

用变性高效液相色谱术筛查甲基化CpG结合蛋白2基因变异

目的用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)分析和DNA测序筛查甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)基因突变,评价DHPLC检测MECP2基因变异的可用性。方法建立检测MECP2基因变异的DHPLC分析法,对52例孤独症患儿MECP2基因3个外显子分为8个片段进行PCR扩增,扩增产物用DHPLC筛查,并以DNA测序验证。结果在Exon 4-1、4-2、4-3、4-4片段,分别发现有17个、2个、2个和1个样本峰型异常,DNA测序分析发现为6种MECP2基因变异。结论DHPLC技术可用于检测MECP2基因变异,方法敏感、重复性好。

泛发性脓疱型银屑病患者外周血单个核细胞甲基化酶及甲基化CpG结合蛋白mRNA的表达水平

目的观察泛发性脓疱型银屑病(generalized pustular psoriasis,GPP)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中DNA甲基转移酶及甲基化CpG结合蛋白(methyl-CpG binding protein,MeCP)mRNA的表达情况,初步探讨DNA甲基化在GPP中可能的作用机制。方法回顾性收集2015年12月至2016年12月在北京协和医院皮肤科门诊或住院治疗的9例GPP患者临床资料;随机选取10例同期在医院接受健康体检的健康人做为对照,年龄和性别与GPP患者相匹配。分别留取10 ml肘正中静脉血,采用密度梯度离心法分离PBMC,应用Trizol法提取PBMC总RNA,采用实时PCR法检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD3、MBD4及MeCP2的mRNA表达水平,并分析年龄及病情严重程度与mRNA表达水平的相关性。结果GPP患者PBMC中DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD4的mRNA表达水平较健康对照组升高[DNMT3a:0.000 17(0.000 06,0.001 15)比0.000 03(0.000 02,0.000 04);DNMT3b:0.000 04±0.000 02比0.000 02±0.000 01;MBD1:为0.001 01±0.000 45比0.000 46±0.000 15;MBD2:0.002 61±0.000 39比0.001 85±0.000 52;MBD4:0.004 29±0.001 60比0.001 57±0.000 55,P均<0.05],年龄及疾病严重度与上述因子mRNA的相对表达水平无相关性(P均>0.05)。结论GPP患者体内甲基化相关调控基因表达异常,但与年龄和疾病严重程度不相关。

不同类型的急性脑梗死患者辅助性T细胞及甲基CpG结合蛋白2表达水平变化及其临床意义

目的探讨不同类型的急性脑梗死患者辅助性T细胞(CD4^(+)T cells, CD4^(+)T细胞)及甲基CpG结合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)表达水平变化及其临床意义。方法选取本院2017年2月-2019年2月收治的急性脑梗死患者156例作为病例组,按照请奥加兰(Orgaran, ORG)治疗急性脑卒中临床研究(Trial of ORG 10172 in acute stroke treatment, TOAST)分型对病例组进行分组:A组(n=82)为大动脉粥样硬化组,B组(n=33)为心源性栓塞组,C组(n=41)为小动脉闭塞组;同期体检健康者155例作为对照组;检测156例病例组和155例体检健康者外周血中CD4^(+) T细胞、MeCP2表达水平。结果 A组CD4^(+) T细胞表达水平明显低于B组、C组以及对照组(P<0.05);B组CD4^(+) T细胞表达水平明显高于C组和对照组(P<0.05)。病例组MeCP2表达水平明显高于对照组(P<0.05);A组MeCP2表达水平明显高于B组、C组和对照组(P<0.05)。CD4^(+)细胞表达水平与A组呈负相关(B=-1.822,P<0.001)。结论不同急性脑梗死亚型中CD4^(+)T细胞表达水平不一样,对于大动脉粥样硬化型的脑梗死患者CD4^(+)T细胞表达水平下降,而MeCP2表达水平的升高也预示急性脑梗死的风险增大,说明CD4^(+)T细胞表达水平检测对于急性脑梗死的分型具有一定的意义,而MeCP2表达水平的变化可以作为预防急性脑梗死的重要指标。

甲基化CpG结合域重组蛋白的表达与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达甲基化CpG结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD)重组蛋白。方法:对人甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,Mecp2)的MBD区行密码子优化,将人工合成的DNA克隆至原核表达载体pGS21a,在大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)中诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达;镍亲和层析柱纯化重组蛋白。表面等离子共振分析重组MBD蛋白与甲基化DNA的结合能力。结果:酶切和核酸测序证实,成功构建了含密码子优化的MBD基因的原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot结果显示,MBD重组蛋白在大肠杆菌中得到表达。亲和层析法纯化后获得了相对分子量为38 000的MBD重组蛋白。SPR分析显示MBD重组蛋白能特异结合甲基化DNA。结论:成功构建含密码子优化的MBD基因的原核表达载体,MBD重组蛋白能在大肠杆菌中表达。