甲异靛诱导白血病细胞HL-60凋亡及机制探讨

背景与目的:甲异靛可有效治疗慢性粒细胞白血病,但其抗白血病的机制尚不清楚。本研究拟观察甲异靛诱导急性白血病细胞株HL-60细胞凋亡的作用及促凋亡机制。方法:用台盼蓝拒染实验观察甲异靛对HL-60细胞增殖抑制作用;琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带;荧光显微镜观察细胞形态学的变化;流式细胞术检测细胞凋亡率和Fas蛋白的表达;免疫蛋白印迹法分析caspase-9、caspase-8、caspase-3、PARP、bcl-2、bax和胞浆细胞色素c的含量。结果:甲异靛可抑制HL-60细胞增殖和诱导其凋亡。20μmol/L甲异靛处理HL-60细胞12～48h可明显抑制HL-60细胞增殖;20μmol/L甲异靛作用于HL-60细胞1h,凋亡百分比为(3.70±0.56)%,当延长至3h、6h和12h凋亡细胞比例分别上升至(19.80±1.13)%、(29.20±2.69)%和(47.05±7.70)%,较阴性对照组[(2.65±0.78)%]明显增高(P<0.05)。HL-60细胞经甲异靛处理3h后出现细胞核染色质浓集和DNA梯形条带。甲异靛处理HL-60细胞1h后死亡受体Fas阳性率由(9.35±0.21)%升高到(21.30±1.27)%(P<0.05)。甲异靛可活化HL-60细胞的caspase-8、caspase-9、caspase-3和PARP,降低抗凋亡蛋白bcl-2的表达和上调促凋亡蛋白bax,并升高细胞浆中细胞色素c的浓度。caspase-3抑制剂(z-DEVD-fmk)可以减少甲异靛对HL-60细胞的增殖抑制,降低细胞凋亡率。100μmol/Lz-DEVD-fmk预处理HL-60细胞后再加入20μmol/L甲异靛,5h后凋亡率为(16.5±5.5)%,甲异靛组为(29.8±5.4)%(P<0.05);12h后计数,抑制剂加甲异靛组活细胞高达(3.57±0.18)×105/ml,甲异靛组活细胞仅为(1.80±0.14)×105/ml(P<0.05)。结论:甲异靛可诱导HL-60细胞凋亡,其机制与caspases和bcl-2家族蛋白的调节有关。

甲异靛对K562细胞凋亡的影响

目的：研究甲异靛对人慢性粒细胞白血病细胞系Ｋ５６２细胞的影响，探讨甲异靛治疗慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）的作用机理。方法：应用剂量反应曲线，台盼蓝拒染实验，细胞形态学，ＤＮＡ电泳，流式细胞仪及ＴＵＮＥＬ标记等多种方法观察甲异靛对Ｋ５６２细胞的作用。结果：甲异靛能明显抑制Ｋ５６２细胞的增殖，并同时诱导Ｋ５６２细胞凋亡。结论：甲异靛治疗ＣＭＬ的机理可能与甲异靛引起白血病细胞受抑和细胞发生凋亡有关。

甲异靛联合imatinib对CML K562细胞的促凋亡作用

目的研究甲异靛联合imatinib促进K562细胞凋亡的作用。方法K562细胞经imatinib或/和甲异靛处理48h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡相关指标(线粒体跨膜电位和AnnexinV/PI)的改变,ELISA方法检测caspase3活性改变,Westernblot检测凋亡相关蛋白(cytC,cIAP1,procaspase3和PARP)的改变。结果与单用组相比,20μmol/L甲异靛与0.3μmol/Limatinib联合应用后,线粒体跨膜电位下降细胞比例明显升高,cytC释放入胞浆,caspase3酶原形式procaspase3减少,caspase3活性升高,其底物PARP被降解,AnnexinV水平升高。结论甲异靛与imatinib合用可协同促进K562细胞凋亡。

甲异靛对K562和HL-60细胞Wnt信号通路的影响

本研究探讨甲异靛对K562细胞和HL-60细胞Wnt信号通路的影响。采用RT-PCR和Western blot方法分别检测甲异靛处理的K562和HL-60细胞中GSK-3β及其下游相关基因及蛋白的表达水平。结果表明:甲异靛可使HL-60细胞中β-catenin和c-myc基因表达下降,但对K562细胞的这两种基因表达无明显影响;甲异靛略能增加HL-60细胞中GSK-3β蛋白表达,但明显降低K562细胞和HL-60细胞中p-GSK-3β和c-MYC蛋白表达水平;甲异靛对K562细胞中β-catenin表达没有明显影响,但能使HL-60细胞中β-catenin表达下降。结论甲异靛可抑制K562细胞和HL-60细胞中Wnt信号通路的传导,降低癌基因和相关蛋白的表达,从而发挥治疗白血病的作用。

治疗慢性粒细胞白血病新药甲异靛

甲异靛是靛玉红的衍生物,为治疗慢性粒细胞白血病(慢粒)的新药。对多种动物移植肿瘤有抑制作用,其抑瘤作用约8倍于靛玉红。经临床对照研究证明:其总有效率和缓解率分别为94%～98%和80%～90%;高于靛玉红对照组87%～90%和60%～80%;与白消安对照组100%和85%相似。本药比较安全,有病人服用本药2～4年,未见明显毒副作用。

甲异靛对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡影响的实验研究

目的:研究甲异靛对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。方法:采用MTT法检测甲异靛对MCF-7乳腺癌细胞的增殖抑制;流式细胞仪测定细胞凋亡率;光学显微镜观察细胞形态的变化;westernblot法测定caspase-3、PARP及bcl-2表达。结果:甲异靛能明显抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖。甲异靛诱导MCF-7细胞凋亡,呈现典型细胞凋亡的形态变化,并呈时间和剂量依赖性,凋亡率最高可达(68.40±4.87)%,在细胞凋亡过程中出现PARP分子断裂和bcl-2下调,未检测到caspase-3。结论:甲异靛能诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡抑制细胞增殖,其发生机制可能与下调bcl-2有关。

3′-甲异靛玉红对不同种系小鼠免疫功能的调节作用

目的:研究3′-甲异靛玉红对不同种系小鼠胸腺、脾淋巴细胞增殖及生物功能影响的调节,探讨其免疫抑制作用的机制。方法:处死8w大雄性BALB/c、C57BL/6以及F1代杂交鼠,取胸腺、脾组织制成单细胞悬液,以5、10、15、20、25μmol/L甲异靛玉红处理各组细胞,MTT法测定各种系小鼠脾和胸腺淋巴细胞增殖;ELISA法测定培养上清IL-12活性;流式细胞仪检测细胞周期,细胞凋亡率及死亡率,细胞内ROS浓度;RT-PCR检测细胞Bcl-2和CDK2基因mRNA水平;荧光显微镜检测细胞Bcl-2、Bax和CDK2蛋白表达率。结果:MTT结果显示,当浓度为15、20、25μmol/L甲异靛玉红作用24h便可明显抑制3种小鼠胸腺、脾淋巴细胞增殖(P<0.05),此效应呈量效、时效依赖性。ELISA结果显示各浓度的甲异靛玉红对各小鼠胸腺和脾细胞各时间点分泌IL-12的功能较对照组显著减低(P<0.05)。RT-PCR显示15μmol/L甲异靛玉红的处理12h后细胞Bcl-2和CDK2的mRNA水平较对照组显著降低。流式细胞仪检测细胞凋亡率及死亡率表明,与对照组比较,15μmol/L甲异靛玉红处理3种不同种系小鼠胸腺细胞、脾细胞均有部分细胞凋亡的现象,细胞死亡率也有升高。15μmol/L靛玉红处理24h后,各组双氢二氯荧光黄(2′,7′-dichlorofluorescein,DCF)阳性的细胞百分比显著高于对照组,3种不同种系小鼠胸腺细胞、脾细胞间无显著性差异。结论:15μmol/L以上甲异靛玉红可逆性抑制不同种系小鼠体外培养的脾及胸腺淋巴细胞增殖,IL-12的分泌也同时被抑制,细胞Bcl-2和CDK基因mRNA和蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高,细胞内ROS水平升高,细胞凋亡。

甲异靛对Jurkat细胞AKT信号通路的影响及其在细胞凋亡中作用的研究

目的：探讨甲异靛对Jurkat细胞AKT信号通路的影响及其在甲异靛诱导Jurkat细胞凋亡中的作用。方法：采用XTT法检测甲异靛对Jurkat细胞的生长抑制作用，应用流式细胞术以及DNA片段分析检测甲异靛诱导Jurkat细胞凋亡的情况。应用Western Blot检测CASPASE家族成员及AKT信号通路相关蛋白在甲异靛作用前后的表达或磷酸化情况。通过电转染方法使Jurkat细胞高表达外源性活化AKT，并进一步分析其对甲异靛诱导细胞凋亡作用的影响。结果：甲异靛抑制Jurkat细胞增殖，随着药物浓度增加抑制作用增强，IC50为10．2μmol／L；5～20μmol／L甲异靛诱导Jurkat细胞凋亡且凋亡效应具有浓度依赖性；甲异靛诱导细胞凋亡过程中伴随CASP ASE2，3，8，9的活化，50μmol／L CASPASE抑制剂z-VAD-fmk可阻断甲异靛诱导的Jurkat细胞凋亡。甲异靛降低Jurkat细胞AKT信号通路中AKT，RAF，PDKl，以及ERKl／2的磷酸化水平；15μmol／L LY294002）（PI3K-AKT抑制剂）可显著提高甲异靛诱导Jurkat细胞凋亡的作用。甲异靛同样诱导高表达外源性活化AKT的Jurkat细胞凋亡，但LY294002不能增强甲异靛对高表达外源性活化AKT的Jurkat细胞的凋亡诱导效应。结论：甲异靛显著抑制Jurkat细胞增殖，通过活化CASPASE途径诱导Jurkat细胞的凋亡。甲异靛诱导细胞凋亡过程中伴AKT磷酸化水平的降低，AKT活性的降低并非甲异靛诱导凋亡的惟一因素，但参与甲异靛与P13K-AKT抑制剂协同诱导Jurkat细胞的凋亡的过程。

甲异靛诱导K562细胞凋亡及对JAK/STAT途径效应基因表达影响的研究

目的探讨甲异靛诱导K562原代细胞凋亡及对效应基因表达影响的作用。方法 K562细胞甲异靛处理12 h、24 h、48 h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测Bcl-xL、CyclinD1和C-MYC的改变。结果甲异靛作用K562细胞12 h,24 h,48 h组的凋亡率与对照组比较有显著性差异（P均〈0.05）;K562组24 h、48 h与12 h比较有显著性差异（P均〈0.05）。在甲异靛作用12～48 h,C-MYC蛋白含量逐渐减少,而Bcl-xL、CyclinD1无显著变化。结论甲异靛促进K562细胞凋亡,可能与下调STAT5下游C-MYC的蛋白含量表达减少有关。

甲异靛治疗慢性粒细胞白血病8例报道

甲异靛治疗慢性粒细胞白血病８例报道上海第二医科大学附属仁济医院血液科陈芳源，王燕婷，韩洁英，邵念贤上海血液学研究所白血病研究室朱学宏，方智雯，欧阳仁荣１９７７年发现从青黛中提取的靛玉红治疗慢性粒细胞白血病（慢粒）获良好疗效，缓解率达５９．５５％［１］...

3’-甲异靛玉红对不同种系小鼠脾细胞增殖、凋亡及生物功能的调节

背景：靛玉红及其衍生物具有抗炎、抗肿瘤作用，可用于自身免疫性疾病的治疗，但其对正常免疫细胞的作用尚鲜见报道。目的：观察3’-甲异靛玉红对不同种系小鼠脾淋巴细胞增殖及生物功能影响的调节。设计、时间及地点：随机对照实验，于2007-07，2008—02在南方医科大学珠江医院血液科实验室完成。材料：清洁级BALB/c，C57BL/6以及F1代杂交鼠，均雄性，6～8周龄，体质量（20±2）g，由第一军医大学实验动物中心提供。3’-甲异靛玉红由美国Sigma公司提供。方法：取BALB＆，C57BL/6以及F1代杂交鼠脾组织研磨过滤为单个核细胞悬液，以5、10、15、20和25μmol／L3’-甲异靛玉红处理各种系小鼠脾细胞，以未处理的为空白对照，以刀豆蛋白A处理组为阳性对照。主要观察指标：MTT法测定各种系小鼠脾淋巴细胞增殖情况；ELISA法测定淋巴细胞培养上清白细胞介素12活性；流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率及死亡率、细胞内活性氧浓度变化；RT-PCR检测细胞Bcl-2和CDK2基因mRNA水平；荧光显微镜检测细胞Bcl-2、Bax和CDK2蛋白表达率。结果：MTT检测显示，15、20和25μmol／L3’．甲异靛玉红作用24h便可明显抑制3种小鼠脾淋巴细胞增殖俨〈0．05），此效应呈量效、时效依赖性。将25μmol／L3’-甲异靛玉红处理72h后的细胞离心后撤除3’-甲异靛玉红干预继续培养，椎虫蓝记数发现细胞恢复增殖。ELISA检测显示，各浓度3’-甲异靛玉红抑制各种系小鼠脾细胞分泌白细胞介素12，各种系间差异不显著。RT-PCR检测显示，15μmol／L3’-甲异靛玉红处理12h后脾细胞Bcl-2和CDK2的mRNA水平明显降低。流式细胞仪检测细胞凋亡率及死亡率表明，15umol／L的3’-甲异靛玉红可降低各种系小鼠脾淋巴细胞凋亡相关蛋白Bcl，2水平，升高Bax蛋白水平，下调Bcl-2／Bax比例，降低CDK2表达，不同种系小鼠脾细胞均有部分凋亡现象，但死亡率无明显升高。各种系小鼠脾淋巴细胞阻遏于G2／M期，细胞内活性氧水平呈量效、时效依赖性升高，种系间差异不显著。结论：15-25umol／L3’-甲异靛玉红可逆性抑制不同种系小鼠脾细胞的增殖及分泌功能，此效应呈量效、时效依赖性，并启动细胞凋亡程序。

3’-甲异靛玉红对C57BL/6小鼠脾细胞和胸腺细胞功能的作用(英文)

背景：中药3’-甲异靛玉红及，靛玉红衍生物在抗肿瘤的同时对机体正常免疫细胞影响的报道查及较少。目的：观察3’-甲异靛玉红对C57BL／6小鼠胸腺、脾淋巴细胞增殖的影响。设计、时间及地点：随机分组细胞病理学观察实验，于2007-08／2008-01在南方医科大学珠江医院完成。材料：实验动物为C57BL／6小鼠，雄性，6-8周龄，体质量（204-2）g。方法：取C57BL／6小鼠胸腺、脾组织研磨过滤为单细胞悬液，应用5，10，15，20，25μmol／L甲异靛玉红处理C57BL托小鼠胸腺和脾细胞。以未经任何药物处理的C57BL／6小鼠作为空白对照，以给予刀豆蛋白A处理的C57BL／6小鼠为阳性对照。主要观察指标：①MTT法测定C57BL／6小鼠脾和胸腺淋巴细胞的增殖。②ELISA法测定培养上清中自细胞介素12活性。③流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率及死亡率，细胞内活性氧浓度。④RT-PCR法检测细胞bcl-2和cdk2 mRNA水平。⑤荧光显微镜检测细胞Bcl．2、Bax和CDK2蛋白表达率。结果：15，20，25μmol／L甲异靛玉红作用24h均可明显抑制C57BL／6小鼠胸腺、脾淋巴细胞增殖（P〈0．05），并呈量效、时效依赖性。各浓度的甲异靛玉红对C57BL／6小鼠胸腺和脾细胞各时间点分泌白细胞介素12的功能较对照组明显减低（P〈0．05）。15μmol／L的3’-甲异靛玉红可导致C57BL／6小鼠胸腺、脾淋巴细胞凋亡相关蛋白bcl-2和细胞周期蛋白cdk2 mRNA表达水平均减低，Bcl-2的蛋白表达水平降低，CDK蛋白表达减低，Bax表达水平升高，Bcl-2／Bax比例明显下降，启动细胞凋亡。15μmol／L的3’-甲异靛玉红将C57BL／6小鼠胸腺、脾淋巴细胞阻遏于G2／M期，细胞内活性氧水平呈量效、时效依赖性升高。结论：一定浓度范围甲异靛玉红可逆性抑制C57BL／6小鼠体外培养的脾及胸腺淋巴细胞增殖，同时抑制白细胞介素12的分泌，并启动细胞凋亡。

甲异靛对K562原代细胞凋亡作用研究

目的探讨甲异靛诱导慢性髓系细胞白血病K562细胞株凋亡的作用。方法K562细胞经20μm／L甲异靛处理12h、24h、48h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期。结果K562未经甲异靛作用时凋亡率[（1．0±0．36）％]与人体正常细胞系NIH3T3凋亡率[（2．6±0．39）％]相比，差异有统计学意义（P〈0．05）；K562细胞空白组凋亡率为（1．0±0．36）％，12h组为（12．5±0．69）％，24h组为（19．4±1．07）％，48h组为（42．5±3．22）％，与NIH3T3细胞组同时间比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；k562组12h、24h、48h与空白组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。甲异靛能使K562细胞阻滞于G2／M期，G2／M期细胞比例增加，G0／G1期和S期细胞减少。结论甲异靛对体外K562细胞有诱导凋亡作用，其作用与时间成正相关关系。甲异靛可使K562细胞阻滞于G2／M期。

甲异靛抗肿瘤作用及对Wnt信号转导通路的影响

目的：研究甲异靛对人白血病K562、HL-60细胞和人结肠癌HT-29细胞的抗肿瘤作用及对Wnt信号传导通路的影响。方法：采用MTT法和集落形成法分别观察甲异靛对K562、HL-60和HT-29细胞的生长抑制作用和肿瘤细胞克隆原形成的抑制作用；流式细胞术分析甲异靛对K562、HL-60和HT-29细胞周期的影响；采用Western blotting分析方法和RT-PCR法分别观察甲异靛在蛋白和基因水平上对Wnt信号转导通路的影响。结果：甲异靛对K562、H1760和HT-29均具有较强的生长抑制作用，能抑制K562、HL-60和HT-29细胞克隆原集落的形成；甲异靛可使K562、HL-60和HT-29细胞阻滞在S期；抑制K562、HL60和HT-29细胞Wnt信号转导通路中的GSK-3β。在基因水平对细胞内总β-catenin无明显影响，但可使c-myc mRNA表达量减少；在蛋白水平甲异靛可降低β-catenin和c-myc蛋白表达。结论：甲异靛明显抑制K562、HL-60和HT-29细胞的增殖，可能与其主要使肿瘤细胞阻滞在S期，抑制肿瘤细胞内Wnt信号转导通路GSK-3β表达、β-catenin和c-myc蛋白表达有关。

甲异靛对1型糖尿病大鼠心肌损伤的修复作用

目的观察甲异靛对糖尿病大鼠Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白在1型糖尿病大鼠心肌中表达的影响,明确其在糖尿病心肌病发生、发展中的作用。方法 SD♂大鼠腹腔一次性注射链脲佐菌素建立1型糖尿病大鼠模型,取模型成功大鼠分为糖尿病4、8周模型组以及甲异靛4、8周给药组。尾静脉采血检测空腹血糖值;HE染色法观察心肌病理结构变化;Western blot和免疫组织化学法检测心肌GSK-3β、p-GSK-3β、Wnt2、β-catenin、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65蛋白表达变化。结果与正常对照组比较,1型糖尿病大鼠血糖值明显升高,体质量明显下降(P<0.01),8周甲异靛给药组大鼠血糖与糖尿病组比较明显下降(P<0.01);显微镜下能观察到糖尿病模型组大鼠心肌不同程度局灶性心肌细胞肥大、溶解性坏死、纤维组织增生等,甲异靛给药组大鼠心肌病变较糖尿病模型组有不同程度的缓解。糖尿病模型大鼠相对于正常对照组,心肌p-GSK-3β、Wnt2、β-catenin、p-NF-κB-p65表达升高,尤其是8周时,差异有显著性(P<0.01),给药组的蛋白表达与DM模型组比较明显降低(P<0.01)。结论甲异靛可能是通过降低Wnt2、β-catenin、GSK-3β等蛋白的表达,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病大鼠体内的激活,参与修复糖尿病大鼠的心肌损伤及炎症过程,进一步研究该药在糖尿病大鼠心肌损伤修复中的作用机制,将为糖尿病心肌病找到新的治疗靶点提供理论依据。

甲异靛治疗β地中海贫血的初步研究

目的 探索甲异靛对 β地中海贫血患儿的临床疗效以及甲异靛对类 β珠蛋白基因转录及表达的影响。方法 9例β地中海贫血患儿服甲异靛治疗 ,观察治疗过程中患儿临床症状及血液学改善情况 ,并采用荧光定量RT -PCR及血红蛋白肽链电泳分析技术检测患儿服用甲异靛后 β、γ珠蛋白mRNA及珠蛋白肽链含量的变化。结果 患儿服用甲异靛后 ,血红蛋白含量有不同程度上升 ,不良反应轻微 ;γ珠蛋白mRNA及γ珠蛋白肽链含量明显升高 ,经t检验 ,差别有显著性意义 (P <0 .0 1 ) ;β珠蛋白mRNA及 β珠蛋白肽链含量无明显变化 ,与服药前相比无显著性差异 (P >0 .0 5)。结论 口服甲异靛可以促进β地贫患儿γ珠蛋白基因转录及肽链合成 ,血红蛋白含最上升 ,从而改善患儿临床症状 ,不良反应轻微。

利用定量蛋白组学的方法研究甲异靛诱导K562细胞凋亡的机制

目的:利用串联质谱标签系统(tandem mass tag,TMT)标记定量蛋白组学的方法,检测白血病细胞系K562细胞经甲异靛(meisoindigo)处理后蛋白表达的改变,探讨甲异靛诱导白血病细胞凋亡的作用机制。方法:用CCK8法检测甲异靛对K562细胞的半抑制浓度(inhibitory concentration 50,IC50),流式细胞术检测不同浓度甲异靛诱导K562细胞的凋亡水平。K562细胞经终浓度为0. 2%DMSO(对照组)和20μmol/L甲异靛(实验组)处理2 h后,提取总蛋白,TMT标记,高效液相色谱分级和质谱定量蛋白组学技术鉴定肽段和丰度信息,并进行3次技术重复。用Mascot软件鉴定蛋白,用GO(gene ontology)注释、富集和聚类分析方法分析差异表达蛋白。结果:在K562细胞系中,甲异靛以剂量依赖的方式诱导K562细胞凋亡(r=0. 98);蛋白质组学分析结果显示,共鉴定出蛋白质5 544个,其中有定量数据的蛋白质4 792个。与对照组相比,在实验组中表达差异1. 5倍以上的蛋白有8个,其中4个蛋白表达上调,4个蛋白表达下调,差异变化的蛋白主要与活性氧代谢相关。结论:应用定量蛋白质组学分析表明,包括DDIT4等蛋白的表达在甲异靛处理K562细胞系早期发生明显改变,提示活性氧代谢过程的改变可能在甲异靛促进凋亡的机制中发挥了重要作用。