甲氨蝶呤载药囊泡在小鼠实验性牙周炎治疗中的作用研究

目的探究甲氨蝶呤载药囊泡对小鼠实验性牙周炎的治疗作用。方法分离人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的细胞外囊泡(EVs)。构建甲氨蝶呤(MTX)载药囊泡(MTX-EVs)并通过扫描电镜及动态光散射仪(DLS)对构建的载药囊泡进行形态大小分析,通过蛋白质印迹法对其表面特异性蛋白进行鉴定。选取4~5周C57BL/6J雄性小鼠,其中通过盲抓法随机抽取8只不做处理,正常饲养作为对照组(由第四军医大学实验动物中心提供),其余小鼠利用脂多糖(LPS)(2 g/L,5μl)牙周局部注射诱导小鼠牙周炎模型,间隔1天注射1次,诱导2周。将成功诱导牙周炎模型小鼠通过盲抓法随机分为4组,每组8只。分别为LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组。牙周局部治疗2周后,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测牙龈组织炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的质量浓度。通过显微CT(micro-CT)、HE染色评估对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组小鼠的牙槽骨吸收情况。流式细胞仪分析牙龈组织中γ干扰素(IFN-γ)阳性细胞的占比。结果扫描电镜结果显示EVs和MTX-EVs呈圆形或椭圆形,DLS粒径分析证明EVs粒径在200 nm左右,MTX-EVs粒径在300 nm左右。ELISA结果显示,对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度分别为(28.86±2.76)、(51.50±2.04)、(35.26±2.40)、(45.49±2.04)、(35.77±3.49)ng/L;LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度均显著低于LPS组(均P<0.05);LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度显著低于LPS+EVs组(P<0.05)。对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度分别为(125.44±4.12)、(221.64±10.59)、(178.16±16.90)、(181.09±18.22)、(170.15±9.04)ng/L;LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度均显著低于LPS组(均P<0.05);LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度显著低于LPS+EVs组和LPS+MTX组(均P<0.05)。对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度分别为(320.27±38.68)、(479.62±40.94)、(342.18±25.89)、(415.88±12.01)、(325.75±30.83)ng/L;LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度均显著低于LPS组(均P<0.05);LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度显著低于LPS+EVs组及LPS+MTX组(均P<0.05)。micro-CT扫描结果显示,对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组小鼠右上颌第一磨牙第一牙根处釉质子骨质界到牙槽嵴顶的距离分别为(0.11±0.03)、(0.28±0.02)、(0.23±0.03)、(0.20±0.04)、(0.18±0.03)mm,与LPS组相比,LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组骨吸收均得到不同程度的抑制,差异均有统计学意义(均P<0.05),其中LPS+MTX-EVs组与LPS+MTX组及LPS+EVs组相比,骨吸收抑制效果最好,且差异均有统计学意义(均P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,LPS组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IFNγ阳性细胞占比分别为(11.77±1.02)%、(6.87±0.65)%及(4.15±0.92)%,LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比均显著低于LPS组(均P<0.05),LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比显著低于LPS+EVs组(P<0.05)。结论MTX-EVs可有效改善牙周炎模型小鼠牙周局部炎症环境,减少小鼠牙槽骨骨吸收。