甲烷单加氧酶的研究进展

甲烷氧化细菌在转化甲烷制造新型燃料、单细胞蛋白和新功能酶生产、污水处理等方面有着潜在的应用前景,因此,甲烷单加氧酶作为其代谢过程中重要的酶系也受到人们的广泛关注。我们简要综述了近年来对甲烷单加氧酶的性质、结构、催化机理等方面的研究,特别是对颗粒性甲烷单加氧酶的相关性质进行了详细的阐述。

甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的研究进展

甲烷氧化菌是以甲烷作为唯一碳源和能源进行同化和异化代谢的微生物,其关键酶之一是甲烷单加氧酶(MMOs),可以在氧气的作用下催化甲烷等低碳烷烃或烯烃羟基化或环氧化,甲烷氧化菌在自然界碳循环和工业生物技术中具有重要的应用价值。因此,近20年来对于甲烷氧化菌和MMOs的研究一直倍受生物学家的关注。以下从现代生物技术的角度,对近年来国内外在甲烷氧化菌的分类与分布,MMOs的结构与功能、甲烷氧化菌与MMOs的基因工程等方面取得的研究成果进行了总结,全面综述了甲烷氧化菌及MMOs的应用基础研究现状,并对其今后的研究和应用方向提出了展望。

甲烷单加氧酶的催化反应机理研究

本文就甲烷单加氧酶近年来在催化反应机理方面的最新研究成果进行了详细阐述。甲烷 C—H键的活化机理主要包括自由基回弹机理和协调的氧插入机理。运用自由基探针底物和量化计算等方法对烷烃羟基化反应机理的直接研究表明 ,目前没有一个统一的机理来解释甲烷单加氧酶的反应过程。反应机理的类型可能取决于 MMO的来源或者其他因素。对甲烷单加氧酶的几种中间化合物的各种光谱学研究有力地推动了机理研究的发展。

甲烷单加氧酶的化学模拟——酚氧双羧酸根桥联Fe_2(Ⅲ)和Mn_2(Ⅲ)配合物合成、表征及催化性能

合成表征了酚氧、双羧基桥联双组氨酸的手性双铁核配合物和双锰核配合物,研究了它们催化亚碘酸苯对烯烃的环氧化反应和对环烷烃的羟化反应.结果表明这种Fe_2(Ⅲ)和Mn_2(Ⅲ)配合物均是有效的甲烷单加氧酶(MMO)模型化合物,其中Fe_2配合物能较好地再现MMO的某些性质,如电子光谱等.Fe_2配合物催化苯乙烯环氧化反应生成环氧苯乙烷的产率为840％(以催化剂计),且R-(+)-构型对映体过量(e.e.)达45.4％,相应的Mn_2配合物则以7080％产率给出环氧苯乙烷,R-(+)-构型对映体过量51.6％.Mn_2配合物还能够催化环己烯和环己烷的氧化反应,产物及其分布分别为环氧环己烷3880、环己烯醇603、环己烯酮189和环己醇1053、环己酮639％(以催化剂计).EPR研究表明MM=O是反应的活性中间体.

甲烷单加氧酶的催化机理

研究了来源于Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓｓｐ．ＧＹＪ３菌的甲烷单加氧酶（ＭＭＯ）的催化机理．结果表明，用还原剂处理羟基化酶可得到不同还原态的羟基化酶，其中全还原态的羟基化酶具有ＭＭＯ催化活性，还原酶和调节蛋白单独存在时均没有ＭＭＯ活性，确定了羟基化酶组分是ＭＭＯ的催化活性中心．用紫外光谱法证实了ＮＡＤＨ和还原酶之间的相互作用，即还原酶接受ＮＡＤＨ的电子，使氧化态的ＦＡＤ转化为还原态的ＦＡＤ．ＭＭＯ的电子传递过程为ＮＡＤＨ→还原酶→羟基化酶．调节蛋白作用于还原酶和羟基化酶的电子传递过程能使ＭＭＯ的活性提高４０倍．

一个Ⅱ型甲烷氧化菌中甲烷单加氧酶羟基化酶的分离纯化和理化性质

甲烷氧化细菌能够催化甲烷和一系列小分子烃类化合物的羟基化反应,对控制全球变暖起着重要作用,在工业催化和生物除污中具有非凡的潜能。应用层析方法纯化了Ⅱ型甲烷氧化细菌MethylosinustrichosporiumIMV3011中甲烷单加氧酶的羟基化酶,并对其进行了表征。凝胶过滤法测定了该酶分子量为201.3kD;SDS-PAGE表明羟基化酶含有三个亚基(αβγ),分子量分别为58kD、36kD和23kD,比较两种方法证明该羟基化酶是一个同型二聚体构型(αβγ)2,总分子量为234kD。薄层等电聚焦测定该酶的等电点为5.2。酶的比活力为603.6nmol/(min.mg),活力回收为34.3%。HPLC法测定该酶的纯度在95%以上。原子吸收光谱显示每分子羟基化酶中含有3.02个Fe原子。羟基化酶的稳定性pH值为6.2～7.5,稳定性温度为低于35℃。菌株IMV3011的细胞表观构型呈现了长型、稍微弯曲的杆状形态。

甲烷单加氧酶的催化性能

研究了来源于Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓｓｐ．ＧＹＪ３菌的甲烷单加氧酶（ＭＭＯ）的催化性能．结果表明，当组成该酶的三个组分，羟基化酶、调节蛋白Ｂ和还原酶的摩尔比为１∶１．７∶２．０时，重组的ＭＭＯ体系酶的比活最高，为３４２ｎｍｏｌ／（ｍｇ·ｍｉｎ）．当反应体系的ｐＨ在６．５～７．５时，ＭＭＯ酶的活力最大．研究了纯ＭＭＯ催化甲烷羟基化反应和丙烯环氧化反应的特性，以及金属离子和电子给体对ＭＭＯ催化反应的影响．

外源电子给体对甲烷单加氧酶催化丙烯环氧化反应活性的影响

以丙烯氧化反应为指标研究了不同外源电子给体对甲烷细菌(Methylomonas sp.GYJ30)休止细胞催化活性的影响。结果表明甲烷、甲醇、甲醛和甲酸盐作为电子给体加入反应中,将甲烷单加氧酶催化丙烯环氧化反应活性分别提高5.3,12.7,10和12.4倍。以甲烷和甲醛作为外源电子给体时提高初始浓度对甲烷单加氧酶具有抑制作用;而以甲醇和甲酸盐作为电子给体时提高初始浓度对甲烷单加氧酶催化活性无明显抑制作用。研究了甲醇作为电子给体时它的代谢、环氧丙烷的积累以及催化反应活性与反应时间的关系。

颗粒性甲烷单加氧酶的研究

从甲基弯菌 (Methylosinustrichosporium)IMV3 0 1 1 (简称M 3 0 1 1 )的膜中分离纯化出颗粒性甲烷单加氧酶 (ParticulateMethanemonooxygenase,简称pMMO)和NADH脱氢酶。Cu2 + 、不同外源电子给体、EDTA等对pMMO活性的都有影响 ;测定了pMMO分子量 ,以及其活性中心金属离子含量。对于M 3 0 1 1 ,培养基中Cu2 + 浓度对pMMO的生成和活性没有影响 ;但在分离纯化过程中对pMMO稳定性有明显影响。电镜结果显示 ,Cu2 + 浓度对pMMO的数量有较明显的影响。对于纯化的pMMO ,对苯二酚仍是有效的电子供体 ,而NADH却是无效的电子供体。纯化过程中采用对苯二酚作为pMMO活性分析时的电子供体 ,排除了共纯化NADH脱氢酶的必要 。

磁场对Schiff碱配合物模拟甲烷单加氧酶催化性能的影响

The influences of magnetic fields on the biocatalytic properties of Schiff base mono- and dinuclear complexes for the monooxygenation of cyclohexane by PhIO were studied. It was found that the catalytic activities of these catalysts increase with the increase of the outside magnetic field intensity used, and the effects of magnetic field on the catalytic properties of these dinuclear complexes generally increase with the increase of the number of unpaired d electrons of the metal ion and the magnetic exchange between the two metals in these dinuclear complexes. Furthermore, it was found that the effect of magnetic field on the iron complex was greater than that on the other metallic complexes, and the effect of magnetic field on the mononuclear complex was greater than that on the dinuclear complex.

甲烷单加氧酶的催化性能和活性中心结构

甲烷单加氧酶是甲烷利用细菌代谢甲烷过程中的重要酶系，它能够催化烷烃羟基化和烯烃环氧化反应；还能催化降解氯代烃类，可用于环境中氯代烃类化合物污染的治理，是具有广泛应用前景的生物催化剂．甲烷单加氧酶是含有μ－氧桥双核铁催化活性中心的蛋白，它的研究对分子氧的活化、化学催化剂的设计具有重要意义．文章介绍了甲烷单加氧酶催化性能和机理的最新研究进展．

甲烷单加氧酶化学模拟研究进展

本文综述了近年来对甲烷单加氧酶进行结构模拟和催化功能模拟研究工作的进展情况。就结构模拟而言,已合成和表征了很多模型化合物,并与天然酶进行了比较,获得了一些能较好地再现天然酶活性中心结构特征和谱学特征的模型化合物。在催化功能模拟方面,少数体系能将环己烷等烃类转化为醇类或酮类。而真正能把甲烷转化成甲醇的体系仅有一例报道,这方面的工作比较薄弱,尚待加强。

甲基单胞菌M ethy lomonas sp.GYJ3的生长特性及产甲烷单加氧酶特性

研究了甲基单胞菌 Methylomonas sp.GYJ3发酵培养过程中生长特征和产酶特征 ,结果表明该菌株在生长过程中产酸 ,通过控制发酵过程中 p H可提高细胞的生长密度 ,其生长周期较摇床发酵短 .细胞中甲烷单加氧酶产生于细胞的对数生长期 ,在 70 h以后甲烷单加氧酶活性不再增加 ,最高活性为 3.97nmol环氧丙烷 / min· mg干细胞 .同时研究了细菌生长过程中甲烷的利用 ,结果表明每克甲烷的消耗可产生 0 .69g细胞干重 .考察了 Cu2 +浓度对细胞产生可溶性甲烷单加氧酶和颗粒性甲烷单加氧酶的影响 .并由此建立了 GYJ3菌的连续发酵动力学模型 .

甲基单胞菌Methylomonas sp.GYJ3中甲烷单加氧酶还原酶组分的纯化和性质

Ｍｅｔｙｌｏｍｏｎａｓｓｐ．ＧＹＪ３菌的甲烷单加氧酶（ＭＭＯ）粗酶提取液经ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ阴离子交换层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤层析和ＤＥＡＥ－ＴＳＫｇｅｌＨＰＬＣ分离纯化出ＭＭＯ还原酶组分．经ＨＰＬＣ分析，纯度大于９５％，纯化倍数为４．４，加入至ＭＭＯ羟基化酶和调节蛋白Ｂ的体系中表现比活为２２８ｎｍｏｌ环氧丙烷每分钟毫克蛋白．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳表明还原酶由一种亚基组成，分子量４２ｋＤ．ＩＣＰ－ＡＥＳ测定还原酶的Ｆｅ含量为１．８３ｍｏｌＦｅ每ｍｏｌ蛋白．ＵＶ－Ｖｉｓ光谱表明还原酶除２８０ｎｍ蛋白质特征峰外在４６０ｎｍ有最大吸收峰，且Ａ２８０ｎｍ／Ａ４６０ｎｍ为２．５０，与其它黄素一铁硫蛋白相似，推测还原酶可能含一个ＦＡＤ辅基和Ｆｅ２Ｓ２中心．在厌氧条件下，还原酶能够和ＮＡＤＨ作用，ＵＶ－Ｖｉｓ光谱分析表明还原酶４６０ｎｍ处特征吸收峰消失，说明在ＭＭＯ催化过程中还原酶接受ＮＡＤＨ的电子．ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ阴离子交换层析分离出调节蛋白Ｂ，部分纯化的调节蛋白Ｂ的分子量大约在２０ｋＤ，它能够提高ＭＭＯ比活性４０倍，ＭＭＯ还原酶和调节蛋白Ｂ单独存在时不具有ＭＭＯ?

甲基单胞菌Methylomonas sp.GYJ3中甲烷单加氧酶羟基化酶组分的纯化和性质

Methylomonassp．GYJ3菌株中经DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换层析和SephacrylS300凝胶层析分离纯化出甲烷加氧酶羟基化酶组分．经HPLC分析，纯度大于90％，分子量为240kD，纯化倍数为3．9，比活为225nmol环氧丙烷每分钟毫克蛋白．SDS-PAGE表明，羟基化酶由三个亚基组成，亚基分子量为56、43、27kD．ICPAES测定羟基化酶的Fe含量为2.1molFe每摩尔蛋白．HPLC法用于甲烷单加氧酶羟基化酶组分的纯化，纯化的羟基化酶组分比活为541nmol（环氧丙烷）每分钟毫克蛋白，是两步LC法纯化的羟基化酶的两倍，Fe含量为3．78molFe每摩尔蛋白．催化性质研究表明羟基化酶能够被化学还原剂还原为还原态羟基化酶，还原态的羟基化酶单独存在时表现出MMO活性，说明它是MMO活性中心，天然态的羟基化酶单独存在时无MMO活性，加入粗酶液中MMO活性明显增加，说明GYJ3菌中MMO是一个复合酶系．

甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的研究进展

甲烷氧化菌在全球大气甲烷平衡中起着重要的角色,同时甲烷氧化菌中所含特征酶甲烷单加氧酶又具有将由于甲烷氧化菌能氧化一系列的烷烃类、烯烃类以及取代型脂肪族类化合物,因而在生物修复、生物催化和温室气体甲烷的吸收中具有的应用前景和潜力。该文对甲烷氧化菌的分类,甲烷单加氧酶的特性以及在工业应用方面的研究作了简单的概述,分析目前将甲烷氧化菌或甲烷单加氧酶应用于工业化生产存在的问题,并指出今后应加强研究的方面。

甲烷氧化菌Methylomonas sp.GYJ3中甲烷单加氧酶基因与16S rRNA序列分析

甲烷氧化细菌中的关键酶系甲烷单加氧酶是一个含双核铁的多组份氧化酶,常温、常压下能够催化甲烷转化为甲醇。对甲烷氧化细菌Methylomonas sp.GYJ3中溶解性甲烷单加氧酶基因和16SrDNA进行了测序与分析。利用已知相关基因数据库信息,设计了PCR引物和测序引物,获得了满意的测序结果。全长的溶解性甲烷单加氧酶基因为5690bp,部分16S rDNA的序列长度为1280bp。与已发表的甲烷氧化细菌中甲烷单加氧酶进行了比较,结果表明MMOX组份中氨基酸序列的同一性为78%到99%,基因序列的同一性为71%到97%,6个组份中orfY片段的同一性相对较低。MMOX氨基酸序列的多序列联配表明,MMOX序列具有高度保守性,特别是在双核铁中心区域。16S rDNA进化分析显示Methylomonas sp.GYJ3与γ蛋白细菌是相关联的,基于MMOX氨基酸序列的进化分析证明,与Methylomonas sp.GYJ3最近似的菌株是Ⅰ型甲烷氧化细菌Methylomonas sp.KSWⅢ。综合分析表明,菌株GYJ3属于Ⅰ型甲烷氧化细菌Methylomonas sp.属。这个结果为Ⅰ型甲烷氧化细菌也能表达溶解性甲烷单加氧酶提供了新的证据。羟基化酶的理论等电点是6.28,理论分子量为248874.41Da。

甲烷单加氧酶的高压离子交换色谱分离

甲烷单加氧酶(methane monooxygenase,ECI·14·1 3.25,以下简称MMO)是近年来发现的,能够在温和条件下活化分子氧(0_2)并将其直接插入到烷烃(如下式)

甲烷单加氧酶催化机理的研究进展

甲烷单加氧酶是甲烷营养细菌代谢过程中的重要酶系,同时也是一类能够很好地催化底物分子单加氧反应的生物催化剂,在工业应用、医药和环境治理方面有着广泛的应用前景。文章综述了近年来在甲烷单加氧酶催化机理方面的研究,着重阐述了含非血红素双铁核的结构及活化氧分子和底物的机理。

模拟含双锌核的甲烷单加氧酶催化甲烷和乙烷羟基化理论研究

采用密度泛函B3LYP方法,研究含双锌核的甲烷单加氧酶催化底物CH3X(X=H,CH3)羟基化的反应机理。用cis-(HCOO)(C3N2H4)Zn2(μ-O)2(COOH)(C3N2H4)(其中C3N2H4=咪唑)模拟双锌核甲烷单加氧酶中的关键化合物Q。研究表明,反应通过自由基回弹机理发生。首先,底物CH3X(X=H,CH3)与Q中的一个桥形氧发生相互作用生成分子复合物QCH3X。然后,Q中的一个桥形氧进一步夺取底物中的氢原子,生成QH和XCH2双自由基。这两种双自由基很容易结合生成醇类分子复合物PXCH2OH,其中P=cis-(HCOO)(C3N2H4)Zn(μ-O)Zn(COOH)(C3N2H4)。最后,分子复合物PXCH2OH脱去羟基化合物XCH2OH生成P。在298.15K和1atm的条件下,含双锌核甲烷单加氧酶Q催化CH4和CH3CH3羟基化反应在蛋白质溶液中的速率常数分别为6.414×10-19和1.542×10-6dm3.mol-1.s-1。