嗜热自养甲烷杆菌DX01抗胁迫蛋白质的分离纯化与鉴定

从中国广东温泉分离得到一株嗜热自养甲烷杆菌DX01(Methanothermobacter marburgensis DX01)。分析嗜热自养甲烷杆菌DX01在不同生长温度的细胞全蛋白质图谱,分离得到一个抗胁迫相关蛋白质---甲基辅酶M还原酶I,它在70℃时上调表达,以此帮助宿主抵抗高温引发的胁迫影响。PCR克隆了甲基辅酶M还原酶I的基因全序列,系统发育分析表明甲基辅酶M还原酶I在不同的产甲烷菌株中保守性很高,M.marburgen-sis DX01与M.thermoautotrophicus和M.marburgensis Marburg的序列相似度分别是97.6%和99.2%。实时定量PCR分析表明甲基辅酶M还原酶I在不同培养温度下的MCR I mRNA表达量有显著的差异,MCR I mRNA表达量随着温度增加而增加。嗜热自养甲烷杆菌DX01菌株的抗胁迫相关蛋白质(甲基辅酶M还原酶I)的分离为研究极端古菌适应极端环境提供了新线索。

嗜热自养甲烷杆菌的抗逆分子机制

为揭示嗜热厌氧古菌适应极端环境的分子机理,分别在不同温度(50℃,60℃,65℃和70℃)培养嗜热自养甲烷杆菌,利用Real-time RT-PCR研究其二硫键异构酶(mtPDI)mRNA的表达情况.结果显示,mtPDI mRNA在上述情况下都有表达,但当温度偏离菌体最适生长温度(65℃),表达量会提高,在50℃和70℃时达到最大.mtPDI mRNA的表达量在50℃下培养时是最适生长温度(65℃)时的10.3倍,在60℃培养时是最适生长温度(65℃)时的2.7倍,在70℃培养时是最适生长温度(65℃)时的9.3倍.说明mtPDI的表达与温度相关,当偏离最适生长温度时mtPDI mRNA表达上调,以帮助体内蛋白质正确折叠.研究表明mtPDI具有协助嗜热自养甲烷杆菌抵抗外界逆境胁迫的作用.

mtPDI外源基因表达体系的构建及耐热性

二硫键异构酶(PDI)是1种重要的蛋白折叠酶,它催化蛋白二硫键的形成和错误配对二硫键的重排,并有抑制错误折叠蛋白聚集的分子伴侣活性。为了研究嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶(mtPDI)的功能,克隆了mtP-DI基因的ORF区,构建了融合基因原核表达载体pET-28a(+)-mtPDI。将质粒pET-28a(+)-mtPDI和pSJS1240共转化E.coliBL21(DE3)构建E.coli(pSJS1240,pET-28a-mtPDI)过表达系统,实现了融合蛋白的高效表达。另外,进行了mtPDI对大肠杆菌的热耐受性研究,E.coli(pET-28a-mtPDI)在30℃和IPTG诱导30 min后,在51℃热刺激60 min后能够提高E.coli的生存率。这一结果表明mtPDI在热损伤保护中具有关键性作用。上述实验结果为嗜热自养甲烷杆菌的二硫键异构酶的抗胁迫机制的深入研究奠定了基础。

嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶活性位点特征

嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶(Mt PDI)催化蛋白质二硫键的形成和异构化,具有分子伴侣活性,在宿主热损伤保护中具有关键性作用.为研究Mt PDI活性结构域中的关键氨基酸位点,通过生物信息学预测Mt PDI的活性结构域(C_(74)PAC_(77)),通过定点突变分析其对二硫键异构酶酶活性的影响.结果显示:Mt PDI活性结构域中C74、C77位点进行突变后,Mt PDI(C74S)、Mt PDI(C77S)、Mt PDI(C74S/C77S)的还原酶活性都明显降低,分别降低32.2%、40.7%和51.2%,双突变的酶活影响大于单点突变.热处理后,突变体Mt PDI(C74S)、Mt PDI(C77S)、Mt PDI(C74S/C77S)对大肠杆菌的热损伤保护明显低于Mt PDI.本研究表明C74和C77是自养甲烷杆菌二硫键异构酶活性区域关键氨基酸,可为深入研究嗜热古菌二硫键的功能和嗜热自养甲烷杆菌抗胁迫机理提供基础.

污泥超高温(65℃)厌氧消化系统启动方案

以高温(55℃)厌氧消化反应器的污泥为接种泥,以不同比例的牛粪和脱水污泥为基质,通过产甲烷潜力测试实验,对污泥超高温(65℃)厌氧消化系统的启动策略进行了初步的探讨.实验结果表明:污泥超高温(65℃)厌氧消化系统具有其可行性;65℃条件下,由于水解酸化过程加快,易发生VFAs(尤其是乙酸和丙酸)的累积.同时,与中温(37℃)和高温(55℃)污泥厌氧消化系统相比,超高温(65℃)系统的产气量虽然较低,但所产沼气中CH4含量明显升高,可以达到79.0%.对系统细菌和古菌进行的多样性分析结果表明:超高温(65℃)条件下,反应器中的细菌以Coprothermobacter、Caldicoprobacter、Ruminiclostridium等极端嗜热的蛋白质水解菌和木质纤维素水解菌为主,不同反应器之间细菌种群多样性的差异是由所投加物料的不同造成的;所有反应器的古菌中,嗜热的氢营养型产甲烷菌Methanothermabactor成为绝对优势菌群,占古菌的比例均超过96%.在超高温反应器(65℃)的启动初期,可适当提高投加基质中牛粪的比例,加快对嗜热产甲烷菌(氢利用型产甲烷菌)的富集,同时避免系统中的VFAs的积累,保证反应器顺利启动.