水牛甲状旁腺素1受体基因CDS区克隆与生物信息学分析

试验旨在对水牛甲状旁腺素1受体(parathyroid hormone 1receptor,PTH1R)基因CDS区进行克隆,并对所获序列进行生物信息学分析,以期丰富水牛PTH1R基因研究的基础数据。提取水牛基因组DNA,以牛PTH1R基因为参考序列(GenBank登录号:NM-001075332.1),应用Primer Premier 5.0软件设计引物序列,运用PCR扩增及测序获得水牛完整CDS区序列,使用DNAMAN、ProtParam、SOPMA、PSORTⅡPrediction等在线分析软件分析PTH1R的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性分析及构建系统进化树。结果显示,试验成功克隆了水牛PTH1R基因完整编码序列,该序列长为2 283bp,CDS区长1 770bp,序列已提交GenBank,登录号:MF380401,可编码589个氨基酸。PTH1R基因CDS区核苷酸序列与黄牛、猪、马、山羊、绵羊和骆驼同源性比对结果显示,其同源性分别为99.4%、93.2%、93.5%、95.3%、98.1%和93.9%,物种之间同源性较高,进化树分析结果与其亲缘关系远近一致,表明水牛PTH1R基因编码区在进化过程中比较保守。蛋白理化性质分析显示,水牛PTH1R蛋白分子式为C2996H4616N792O823S30,分子质量为65 860.22u,半衰期为30h,理论等电点(pI)为8.37,水溶液在280nm处的消光系数为117 770,肽链N端为M(Met),不稳定系数为43.36,属于碱性不稳定蛋白。脂肪系数为88.61,总平均亲水性为0.007,该蛋白属于不可溶性蛋白。二级结构分析显示,水牛PTH1R基因蛋白中包含有218个α-螺旋、114个延伸链、44个β-转角、213个无规则卷曲,与三级结构预测结果相一致。综上所述,PTH1R基因编码区在长期生物进化过程中具有较强的保守性,PTH1R基因的成功克隆及分析为进一步揭示其遗传特性提供了理论依据。

甲状旁腺素1受体(PTH1R)调控成釉细胞MMP-20基因表达的分子机制研究

目的通过进行甲状旁腺素l受体(PTH1R)基因克隆以及真核表达载体的构建,分析PTH1R对成釉细胞MMP-20基因表达的影响.为进一步探讨PTH1R在牙釉质形成以及发育过程中的分子调控方面奠定基础。方法根据引物设计原则设计PTH1R基因的RT-PCR引物,用PCR法扩增得出含有EcoRⅠ和XhoL的PTH1R目的基因片段。通过T4连接酶连接到pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体上。并用双荧光素酶报告基因系统检测MMP-20启动子区域的转录活性。结果①经过PCR引物扩增得到1794BP的基因片段,将获得的重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-PTH1R双酶切分析鉴定,测序结果与GenBank登录基因完全一致。②经双荧光素酶报告基因系统检测得出PTH1R能够上调MMP-20基因的表达水平。结论成功实现了PTH1R基因克隆及真核表达载体的构建,初步证明了PTH1R可能调控MMP-20基因的表达。

甲状旁腺素及其受体对成釉细胞增殖的影响

目的通过体外培养成釉细胞,探讨甲状旁腺素(PTH)对于小鼠成釉细胞增殖的影响。方法首先利用免疫组化方法检测甲状旁腺素1受体(PTH1R)在小鼠牙齿成釉细胞中的表达;然后在细胞培养箱内培养成釉细胞16h,通过利用不同浓度的PTH作用于成釉细胞,噻唑蓝荧光检测PTH对成釉细胞的增殖作用效果。结果免疫组化法检测可知PTH1R在小鼠成釉细胞层中表达呈现阳性;荧光检测发现PTH可显著促进成釉细胞的增殖,尤其是在浓度达到1μg/L时其促进细胞增殖效果达到最高值。结论 PTH1R在小鼠牙齿成釉细胞层中具有较强的表达效应,同时PTH可以促进成釉细胞的增殖,其有效作用浓度与成釉细胞生长密度呈相关关系。

甲状旁腺素通过磷脂酶C非依赖途径激活蛋白激酶C

目的利用基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术的检测PKC激活或PKC-delta激活的报告分子来确定PTH是否可以通过PLC非依赖途径激活PKC和PKC-delta。方法将表达PKC激活报告分子(CKAR)的质粒和表达PKC-delta激活报告分子的质粒转染HEK293细胞,培养72h后通过共聚焦显微镜检测FRET的改变,并以此判断佛波酯(TPA)是否激活PKC和PKC-delta。将表达甲状旁腺素1型受体(PTHR1)的质粒与CKAR质粒或PKC-delta质粒共转染HEK293细胞,培养72h后通过共聚焦显微镜检测FRET的改变,并判断PTH(1-34)、G1R19(1-34)和0.1%的三氟乙酸(TFA)对PKC和PKC-delta的作用。结果在转染CKAR质粒或PKC-delta质粒的HEK293细胞,TPA均使青色荧光与黄色荧光的强度之比(C/Y)增加。在共转染PTH1R质粒与CKAR质粒或PKC-delta质粒的HEK293细胞,PTH(1-34)和G1R19(1-34)均增加了C/Y的值,而0.1%TFA未引起C/Y的改变。结论 PTH与PTHR1结合后通过PLC非依赖途径激活PKC/PKC-delta。

不同浓度葡萄糖对INS-1细胞PTHrP及PTH1R表达的影响

目的探讨不同浓度葡萄糖对INS-1细胞PTHrP/PTH1R表达的影响以及对细胞增殖的作用。方法将大鼠胰岛细胞瘤细胞株根据不同干预条件分为空白对照组,正常葡萄糖组(5mmol/L)组及高浓度葡萄糖(30mmol/L)组,培养96h应用MTT检测各组细胞活力,应用Western blot及RT-PCR检测PTHrP/PTH1R蛋白及mRNA表达。结果空白对照组及高浓度葡萄糖组细胞活力比正常葡萄糖组下降,高浓度葡萄糖组细胞活力低于无糖组,PTHrP和PTH1R蛋白或mRNA在高浓度葡萄糖组中表达显著下调。结论不同浓度葡萄糖可以通过调控PTHrP/PTH1R的水平从而影响INS-1的增殖。

高糖诱导NRK-52E细胞甲状旁腺素相关肽及其受体1表达及氯沙坦干预研究

为探讨甲状旁腺素相关肽（PTHrP）及其受体1（PTH1R）在高糖诱导大鼠。肾小管导管上皮细胞株NRK-52E表达及氯沙坦对其表达干预作用。应用RT—PCR及Western印迹检测空白组（0mmol／L），正常葡萄糖组（5mmol／L）、中高浓度葡萄糖组（16．7mmol／L）及高浓度葡萄糖组（25mmol／L）中PTHrP及PTH1R在NRK-52E细胞表达。然后10μmoL／L氯沙坦及25mmol／L葡萄糖分别干预72h，应用Western印迹检测PTHrP及PTH1R表达情况。结果发现高浓度葡萄糖能上调PTHrP／PTHlR蛋白（PTHrP：0．63±0．12，0．68±0．06，1．02±0．11和1．04±0．08；PTH1R：0．88±O．05，0．87±0．10，1．05±0．11和1．12±0．09）及mRNA表达（PTHrP：0．66±0．08，0．84±0．13，1．57±0．15和1．73±0．21；PTH1R：0．26±0．08，0．28±0．07，2．35±0．10和2．47±0．05）。氯沙坦能显著下调高浓度葡萄糖状态下PTHrP及PTH1R表达（PTHrP0．74±0．15，PTH1R0．98±0．06，均P〈0．01）。提示氯沙坦可以抑制高浓度葡萄糖诱导PTHrP／PTH1R的表达水平，从而可能影响肾小管导管上皮转分化。

甲状旁腺素受体1表达对高糖状态下INS-1细胞功能影响研究

目的观察甲状旁腺受体1（PTHIR）的表达对胰岛B细胞胰岛素合成与分泌功能影响。方法构建出PTHlR基因沉默的细胞模型后，分别应用放射免疫法观察25mmol／LD-葡萄糖处理后对照组、阴性基因克隆组（siPTHlR-NC）、PTHrP组及阳性基因序列组（siPTHlR）细胞内胰岛素含量、葡萄糖刺激胰岛素分泌能力、应用Fluo-3／AM检测INS-1细胞内钙离子浓度及应用INS-1细胞2-脱氧-[^3H]-葡萄糖摄入率检测INS-1细胞葡萄糖转运能力。结果PTHrP组胰岛素分泌能力高于其他3组，siPTHlR组则低于对照组及siPTHlR-NC组（均P〈0．01）；PTHrP组中细胞内胰岛素含量显著高于对照组、siPTHlR-NC及siPTHlR组（均P〈0．01），其他3组间差异无统计学意义；PTHrP组中钙离子浓度水平高于其他3组，siPTHlR组低于对照组及siPTHlR-NC组。PTHrP组中细胞2-脱氧-[^3H]-葡萄糖摄入率高于其他3组。结论高糖状态下PTHlR表达水平与INS-1细胞胰岛素合成与分泌功能有关，可能为INS-1细胞自我保护的一种作用。