腭裂相关基因甲状腺转录因子-2转基因小鼠的生物学特征

目的建立腭裂相关基因甲状腺转录因子-2(TTF-2)转基因小鼠模型,利用转基因动物模型研究TTF-2基因的活动规律和表达模式发生变化时对腭突发育过程产生的影响。方法采用聚合酶链反应法扩增C57BL/6J小鼠基因组TTF-2基因,将其定向插入pBROAD3-mcs载体,构建重组表达质粒pBROAD3-TTF-2,利用显微注射技术把线性化表达载体注射到受精卵的雄原核中,建立TTF-2转基因小鼠。利用特异引物聚合酶链反应和Southern blot方法鉴定转基因小鼠的基因型,采用免疫组织化学法检测TTF-2基因在转基因小鼠腭突组织中的表达。结果共注射原核期受精卵982枚,发育为2-细胞胚胎的580枚,均移植入48个假孕受体昆明白小鼠中,得到胎鼠68只。提取基因组DNA,发现有13只转基因阳性的胎鼠。免疫组织化学法检测显示TTF-2在转基因小鼠腭突中持续表达。结论通过显微注射法使外源基因pBROAD3-TTF-2整合入小鼠基因组中,成功建立了腭突持续表达TTF-2的转基因小鼠模型,其表现型为腭裂。

甲状腺转录因子-2在C57BL/6J小鼠腭突发育过程中的时空变化

目的探讨C57BL／6J小鼠继发腭发育过程中，甲状腺转录因子（TTF）-2表达的时空变化规律，探讨TTF-2在腭突形成中的作用。方法于小鼠妊娠12、13、14、15d分别断颈处死各6只孕鼠，无菌条件取出胚胎，解离腭突。应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Westernblot和免疫组织化学染色方法定量、定位检测TTF-2在腭突中的表达。结果免疫组织化学定位检查在C57BL／6J小鼠的腭突发育过程（E12-E14）中，在腭突中嵴上皮细胞均有TTF-2的表达，而在腭突问充质细胞未见TTF-2的表达；腭突融合时，已不能检测到TTF-2表达。TTF-2在腭突形成、上抬、接触的表达差异具有统计学意义（P〈0．05），以E13为最高，RT-PCR和Westernblot结果一致。结论TTF．2在腭突发育过程中的表达有时空性，推测TTF-2与腭突中嵴上皮细胞的分化抑制和转归相关。

阉割对猪甲状腺转录因子-1、2(TTF-1,2)基因表达的影响

为了研究阉割对甲状腺转录因子-1、2(TTF-1,2)基因的影响,本研究采用荧光定量PCR技术分析阉割与非阉割金华猪甲状腺组织中TTF-1和TTF-2基因在60、90和120日龄时的表达水平。结果表明:非阉割猪TTF-1和TTF-2基因在不同生长阶段的表达量呈稳步上升趋势,阉割猪TTF-1和TTF-2基因的表达基本稳定。TTF-1与TTF-2mRNA的表达量均是在60、90日龄时阉割组高于非阉割组;在120日龄时,阉割组TTF-1与TTF-2mRNA的表达量均低于非阉割组,但差异不显著(P>0.05)。结果,建立的SYBR-Green荧光定量PCR方法可以有效地用于TTF-1和TTF-2基因的表达分析;另外,阉割使得猪甲状腺TTF-1和TTF-2基因在60、90日龄的表达量升高,且TTF-1基因的表达与猪部分肉质性状存在显著的相关性。

TTF-2和TGFβ3在C57BL/6J小鼠腭突发育过程中的表达变化

目的探讨C57BL/6J小鼠继发腭发育过程中,甲状腺转录因子-2(TTF-2)和重组人转化生长因子β3(TGFβ3)的表达及其相互作用规律。方法于妊娠12、13、14d分别断颈处死各6只孕鼠,无菌条件取出胚胎,解离腭突。应用免疫组织化学染色和Western印记方法检测TTF-2和TGFβ3在腭突中嵴上皮细胞的表达。结果在G57BL/6J小鼠胚胎的腭突形成、上抬和融合的发育过程中均有TTF-2的表达,以13d为最高,免疫组织化学和Western印记结果一致。TGFβ3在腭突形成时,腭突中嵴上皮细胞未检测到其表达。腭突上抬时,首次在腭中山嵴上皮细胞中发现TGFβ3表达,两侧腭突融合时,TGFβ3在腭中嵴上皮中的表达最明显,当腭突融合完成后,TGFβ3在腭中嵴上皮中表达减少。结论 TTF-2和TGFβ3两种细胞因子均在腭突中嵴上皮细胞中表达,表明与其分化转归相关。

小鼠甲状腺转录因子-2转基因动物表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建小鼠甲状腺转录因子-2(TTF-2)转基因动物表达载体(pBROAD3-TTF-2),观察其在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)中的表达。方法从C57BL/6J小鼠肝脏组织中提取基因组DNA,利用聚合酶链式反应方法扩增出TTF-2基因1 113 bp开放阅读框,通过DNA重组技术将TTF-2基因片段插入克隆载体pMD18-T中,经测序正确后,再重组于pBROAD3-mcs中,构建转基因动物表达载体pBROAD3-TTF-2,用酶切电泳分析对其进行鉴定。运用脂质体转染试剂将其转染BMSC后,蛋白质印迹法检测TTF-2基因的表达。结果①DNA测序证实目的基因序列正确无突变,酶切电泳分析得到相应的目的片段,大小与理论计算值一致,成功构建转基因动物表达载体pBROAD3-TTF-2。②蛋白质印迹法显示转染的BMSC高表达TTF-2蛋白。结论成功构建了pBROAD3-TTF-2转基因动物表达载体,显示其转染BMSC后TTF-2基因的表达,为下一步建立TTF-2转基因小鼠模型奠定了基础。

地塞米松对小鼠颅颌面部发育的影响

目的:探讨妊娠期注射地塞米松对胎鼠颅颌面部发育的影响。方法:将孕鼠随机分为实验组和对照组,妊娠11.5d实验组给予50mg/kg地塞米松腹腔注射,对照组给予相同剂量的生理盐水。于妊娠14.5、15.5、16.5d取胚胎,记录腭裂数、活胎数及死胎数,切取胎头在体视学显微镜下作头颅颌面组织侧貌分析,采用H-E染色和免疫组织化学显色观察腭部形态变化及骨形态蛋白(BMP)-2和甲状腺转录因子(TTF)-2在鼻中隔软骨中的表达情况。结果:实验组出现明显颅颌面部畸形,下颌体缩短,上颌突角、下颌突角后缩;免疫组织化学检测显示BMP-2和TTF-2在腭裂胎数鼻中隔软骨中持续表达;妊娠14.5～16.5d实验组鼻中隔软骨细胞中BMP-2表达水平依次增强,且同时间实验组表达低于对照组;对照组鼻中隔软骨TTF-2表达呈现波动性,妊娠15.5d表达最高,而实验组在妊娠16.5d仍持续增高,数值高于对照组。结论:地塞米松抑制颅颌面部骨骼发育;BMP-2和TTF-2在鼻中隔软骨持续表达提示其与分化转归相关。

中国人群非综合征型唇腭裂遗传背景研究新进展

非综合征型唇腭裂(NSCL/P)是人类最普遍的颅颌面畸形之一,病因复杂,目前普遍认为其发病机制主要与遗传和环境因素有关。通过流行病学调查、全基因组关联研究和动物模型分析等,在NSCL/P易感基因座的鉴定方面取得了重大进展。围绕中国人群进行的NSCL/P遗传病因学最新研究显示,与NSCL/P发病率有重要关系的易感基因有RhoGTP酶激活蛋白29(Arhgap29)、抑癌基因p53、甲状腺转录因子2(TTF2或FOXE1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、Sprouty基因(SPRY)、脊髓灰质炎病毒受体相关基因(PVRL)。研究表明,Arhgap29、p53、FOXE1、FGF、SPRY及PVRL基因与中国人群NSCL/P的发生有明显关联。同时,单核苷酸位点包括rs4791774(p53)、rs7043516(FOXE1)等在不同的人群中缺乏一致性,甚至会出现背离现象,这可能源于中国民族构成的复杂性以及NSCL/P的遗传异质性。固而有必要针对其遗传背景、作用机制开展进一步研究。