滇龙胆甲羟戊酸二磷酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

为获得滇龙胆GrMDC基因序列,以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆GrMDC基因,并进行原核表达和组织特异性表达分析。结果表明:滇龙胆GrMDC基因(登录号KJ917169)全长1 275bp,GrMDC蛋白相对分子量为46.77kD,pI为5.97;该蛋白可能定位于细胞质,无信号肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;GrMDC蛋白与长春花CrMDC蛋白相似性较高(88.12%),且亲缘关系最近;GrMDC基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为72.77kD(含GST标签26kD),与预期蛋白大小一致;GrMDC基因主要在根中表达。

茶树甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因CsMVD的克隆与表达分析

该研究在茶树转录组测序的基础上,以茶树品种‘福鼎大白茶’的芽叶为供试材料,采用RT-PCR技术,克隆茶树萜类化合物合成途径中的限速酶——甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶全长cDNA序列,命名为CsMVD(GenBank登录号为MF772780);该基因全长1 585bp,其ORF为1 266bp,编码421个氨基酸,蛋白质分子量46.45kD,理论等电点7.10。CsMVD蛋白可能定位于细胞质中,具有MVD1superfamily的保守结构域,不存在跨膜结构和信号肽,具有多个磷酸化位点,部分保守的氨基酸残基决定了蛋白的催化反应特异性和活性。系统进化分析表明,CsMVD与新疆紫草(Arnebia euchroma)MVD的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,CsMVD在茶树不同组织中均有表达,果实中CsMVD的表达量最高,表达水平表现为:果实>茎>根>叶>花;在白茶萎凋过程中,CsMVD基因的表达量在48h结束阶段显著高于0h,推测该基因与茶叶萜类香气化合物形成有关。

甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶及其抑制研究进展

甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶(MDD)是甲羟戊酸途径中的一种重要的酶,它在调节胆固醇等类异戊二烯化合物的生物合成方面起重要作用,有可能成为治疗心血管疾病和癌症的靶标。该文总结了MDD在催化机理、蛋白结构、序列对比分析与残基功能,及其抑制剂研究等方面的成果。

洋常春藤甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因HhMVD的克隆与表达分析

甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Mevalonate diphosphate decarboxylase,MVD)是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶,为研究其在洋常春藤中的基因功能,通过RT-PCR和RACE技术从洋常春藤叶片中克隆获得HhMVD基因的cDNA全长序列,并通过RT-qPCR技术分析其表达规律。结果表明:RACE克隆获得的HhMVD基因cDNA序列全长1 799 bp,包含一个完整开放阅读框(ORF)1 263 bp、5′非编码区(5′UTR)192 bp、3′非编码区(3′UTR)344 bp;该基因编码420个氨基酸,分子质量46.6ku,理论等电点为6.57,不含跨膜区,属于非分泌型蛋白;HhMVD蛋白具有GHMP激酶N端结构域,属于甲羟戊酸激酶系列,与刺五加、人参、三七等同科植物亲缘关系较近。RT-qPCR结果表明,洋常春藤中HhMVD基因的时空表达相对稳定,但与常春藤皂苷含量差异变化之间存在一定的负相关性。洋常春藤HhMVD基因的成功克隆及表达分析研究,为深入探讨其基因功能、阐明其在常春藤皂苷生物合成途径中的作用提供理论依据。

蛹虫草磷酸甲羟戊酸激酶和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的功能分析

【目的】确定蛹虫草甲羟戊酸途径中的2个关键酶——磷酸甲羟戊酸激酶(CmErg8)和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(CmErg19)的功能及其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【方法】通过生物信息学分析鉴定蛹虫草中CmErg8和CmErg19,并采用酵母互补确定其功能是否保守;以蛹虫草尿嘧啶营养缺陷型CmΔpyrG为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对CmErg8和CmErg19进行过表达,观察其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【结果】CmErg8和CmErg19不能互补酵母erg8和erg19突变体的温度敏感表型;CmErg8和CmErg19过表达菌株中麦角甾醇和虫草素含量均有所增加,特别是CmErg19基因过表达可以使虫草素含量提升5倍左右。【结论】本研究揭示了蛹虫草CmErg8和CmErg19的功能,并且发现蛹虫草麦角甾醇合成通路基因可能会影响虫草素含量。

金钗石斛焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的克隆及表达分析

焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶（pyrophospomevalonate decarboxylase,MVD）是甲羟戊酸途径中的关键酶,在植物细胞萜类物质合成代谢过程中发挥着重要的作用。石斛碱作为倍半萜类生物碱,其合成很可能离不开MVD的参与。本研究利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（RACE）技术,首次从金钗石斛中克隆到一个MVD基因,命名为DnMVD（GenBank注册号KY626328）。DnMVD基因cDNA全长1 763 bp,编码一条由424个氨基酸组成的多肽,分子量为47.132 63 kD,等电点6.84。DnMVD编码的蛋白包含GHMP激酶超家族的特异性识别序列,且拥有严格保守的1个亮氨酸、1个天冬氨酸和3个半胱氨酸活性位点,与多种植物MVD高度同源。DnMVD的表达受到菌根真菌的影响,金钗石斛茎中DnMVD的表达量于接菌后期显著高于对照。DnMVD基因的分子鉴定及其在接菌前后金钗石斛茎中的表达特性为进一步解析该基因在金钗石斛石斛碱合成代谢途径及菌根互作过程中的分子调控作用奠定了重要的基础。

牛樟芝菌丝体和子实体三萜含量测定及Se和Mvd基因表达分析

为探讨牛樟芝子实体和不同培养时期的菌丝体中三萜含量及鲨烯环氧酶基因（Se）和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因（Mvd）的表达情况,采用香草醛-冰醋酸法测定菌丝体和子实体的三萜含量,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析甲羟戊酸途径（MVA）中Se和Mvd基因表达水平。结果表明,随着培养时间的推移,当生长至21 d时牛樟芝菌丝体干重逐渐趋于稳定。当培养时间小于28 d时,菌丝体中三萜含量随着培养时间的延长而逐渐增加,且28 d时菌丝体的三萜含量最高,达（39.192±2.025）mg/g,仅次于牛樟芝子实体三萜含量（49.391±2.675）mg/g,玉米芯栽培的牛樟芝子实体三萜含量最低,为（11.530±0.733）mg/g,各样品间三萜含量差异达到显著水平（P〈0.05）。qRT-PCR分析结果表明,培养7 d的菌丝体中Se和Mvd的表达量均为最高,但随着培养时间的继续延长而呈现下降趋势;牛樟芝子实体中Se和Mvd的表达量均较低,与培养28-42 d的菌丝体表达量相当。本研究结果表明牛樟芝的三萜含量可能与其合成途径中相关基因的表达量、培养条件和累积时间有关。

棉花UXS基因生物信息学分析与原核表达

通过生物信息学方法对已克隆的3个棉花UXS基因GhUXS1、GhUXS2和GhUXS3编码产物进行亲疏水性,结构域以及功能等多方面预测,同时将产物连接至pET-32a(+)原核表达载体,并转化BL21(DE3)plys菌株,在IPTG诱导下,利用Western blotting方法检测GhUXS1、GhUXS2和GhUXS3在原核细胞中的表达。生物信息学预测发现3个蛋白均含有UXS家族的保守域。GhUXS1和GhUXS2结构类似,N端含有较为明显的疏水区以及跨膜区,GhUXS3N端缺乏明显疏水区及跨膜区。Western blotting结果显示在体外分别成功表达GhUXS1、GhUXS2和GhUXS3和His标签的融合蛋白。

拟南芥和水稻UXS基因家族生物信息学分析

以6个拟南芥和6个水稻UXS基因家族序列为目标,对其基因结构、保守结构域、基因表达、系统进化等方面进行了综合分析。结果显示,12个UXS基因均有内含子,除OsUXS1基因仅在愈伤组织中表达外,其余11个基因在根、叶以及愈伤组织均有表达。12个UXS基因编码蛋白均存在较大范围的亲水区,有较强的亲水性。12个蛋白结构保守性较强,含有该基因家族的保守域3Beta-HSD和NAD-binding,分成2个亚家族,家族内结构相似的基因功能较为相似。综合分析表明,UXS是一个多基因家族,基因表达范围广,结构保守性强。

茉莉花MVD基因及其启动子的克隆与表达

根据茉莉花转录组数据,采用RT-PCR技术,克隆了茉莉花甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD)基因,命名为JsMVD(GenBank登录号为MH311041.1).采用染色体步移技术分离JsMVD基因5′端上游调控序列,通过实时荧光定量PCR技术检测JsMVD基因在茉莉花植株不同组织及不同激素处理下的表达水平.测序结果表明,JsMVD基因全长cDNA序列的长度为1 500 bp,包含长度为1 269 bp的开放阅读框(ORF),共编码422个氨基酸,亚细胞定位预测该蛋白可能位于细胞质上.JsMVD蛋白含有GHMP激酶N-端和C-端保守结构域,具有多个保守氨基酸残基及ATP结合位点,与野生油橄榄的相似性最高,相似系数达到88%,且进化树显示两者的亲缘关系最近.JsMVD基因5′端启动子序列长度为893 bp,该调控序列包含多种植物激素响应元件和光响应元件.实时荧光定量PCR技术检测结果表明,JsMVD基因在成熟花中的表达量最高,从高到低依次为成熟花、花蕾、茎、叶、根,且受GA、IAA和ABA不同程度的诱导.

将生物信息学与有机化学结合初探酶促反应原理与实践——介绍一个国外本科生实验并讨论其相关问题

21世纪是生命科学与信息科学高速发展的时代,化学作为理科的中心学科与此二者均有紧密的联系。伴随着各种交叉学科的诞生与发展,将信息科学技术整合有机化学方法并用于认知生物大分子进而解决生命科学问题也是大势所趋,而在生物化学与化学生物学基础教学中引入相关内容也具有前瞻性与必要性。国外化学本科的基础教育也切合时宜地以一个生物信息学的最常用软件PyMOL为例设计相关实验,让学生在了解反应中的有机化学机理的基础上,学习酶的三维结构,并探究酶催化该反应的原因。此设计结合了有机化学、生物化学、生物信息学、蛋白质结构生物学等多学科,可以加深学生对多肽与蛋白质的高级结构的认识,并为今后的生物化学学习与研究打下基础,同时有利于培养学生对于化学的兴趣,可谓一举多得。这对于培养交叉学科人才,做出开创性研究极为重要。对国内生物有机化学实验的设计有借鉴作用。

暴马桑黄MVD基因cDNA全长克隆及表达特性分析

【目的】对暴马桑黄中参与三萜合成途径的关键酶——甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD)基因进行克隆及表达特性分析,以了解暴马桑黄三萜合成的调控机制。【方法】利用生物信息学软件对MVD基因cDNA序列进行分析,并采取同源重组方法构建原核表达载体。用qRT-PCR技术分析MVD基因在暴马桑黄不同发育阶段表达特性;以分光光度计法测定暴马桑黄在不同发育阶段的三萜含量和变化规律。【结果】暴马桑黄MVD基因cDNA序列全长1209 bp,编码402个氨基酸,相对分子质量为43.43 ku,命名为SbMVD(登录号为MK977617)。系统进化树表明:暴马桑黄MVD蛋白和紫芝、灰树花MVD蛋白同源性最高。SDS-PAGE结果显示:在65 ku(包含21 ku标签蛋白)附近出现与预期大小一致的目的蛋白条带。qRT-PCR分析及三萜含量测定结果表明:暴马桑黄SbMVD基因转录水平和三萜含量在不同发育阶段呈先升后降的变化趋势,并且两者变化趋势基本一致。【结论】通过对SbMVD基因的克隆及表达特性分析,推测该基因在三萜合成途径中发挥一定作用,为进一步研究该基因在暴马桑黄三萜合成过程中的功能奠定了基础。

不同产地桔梗皂苷生物合成与土壤元素关系的研究

目的 研究桔梗皂苷积累与土壤元素的关系,从基因表达水平明确不同产地桔梗皂苷含量差异的原因,为桔梗药材的科学种植提供理论依据。方法 利用HPLC法和香草醛-冰醋酸比色法测定不同产地桔梗韧皮部和木质部的桔梗皂苷D和桔梗总皂苷含量,实时荧光定量PCR测定6种关键酶基因的表达量,利用原子吸收法、比色法等方法测定土壤元素含量,用Pearson相关性分析法分析土壤元素与桔梗皂苷及其关键酶基因表达量的关系。结果 河南洛阳产桔梗根中的桔梗皂苷D和桔梗总皂苷含量显著高于其他产地,桔梗韧皮部和木质部的桔梗皂苷含量和关键酶基因表达量存在较大差异;相关性分析表明,土壤中Cu、Ca和Zn含量对桔梗皂苷的合成起主要作用,甲羟戊酸焦P酸脱羧酶基因、法尼基焦P酸合酶基因和异戊烯基焦P酸异构酶基因是桔梗皂苷合成过程中的主要关键酶基因,土壤元素对桔梗关键酶基因具有一定的调控作用。结论 土壤元素通过调控关键酶基因进而影响桔梗皂苷的合成,其中土壤中Zn含量起主要作用。