华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因PcoPMK克隆与表达分析

【目的】克隆华中樱磷酸甲羟戊酸激酶基因PcoPMK的cDNA序列,分析该基因在华中樱‘YS01’不同发育阶段花瓣中的表达情况及其编码蛋白质的结构特征和理化性质,为进一步研究PcoPMK基因在华中樱萜烯类物质合成途径中的功能提供参考。【方法】参照近缘物种的PMK同源基因cDNA保守序列设计特异性引物,应用RT-PCR技术扩增PcoPMK基因的cDNA序列,并进行克隆测序,同时应用定量RT-PCR技术分析该基因在‘YS01’不同发育阶段花瓣中的表达情况。应用ORF Finder在线工具预测基因的开放阅读框及编码的蛋白质序列;分别应用ExPASy、SOPMA、Swiss model和CDD在线工具分析蛋白质的理化性质、二级、三级结构和功能结构域;分别应用DeepTMHMM、SINALP 4.0 Server和PredictProtein在线程序预测蛋白质的跨膜结构、信号肽和亚细胞定位;应用MEGA7.0软件构建基因的系统进化树。【结果】华中樱PcoPMK基因开放阅读框序列大小为1530 bp,编码509个氨基酸,GenBank登录号为OR373074。编码蛋白质的相对分子量为55.199 kD,理论等电点为5.68,属于亲水性的稳定蛋白,定位于细胞质。PcoPMK蛋白与扁桃、烟草和拟南芥等代表性物种PMK同源蛋白的序列相似度较高,含有3个典型且保守的蛋白结构功能域和1个ATP结合位点,无跨膜螺旋和信号肽,属于非分泌蛋白。PcoPMK基因在华中樱‘YS01’盛开期花瓣中的相对表达量显著高于花蕾期和半开期(P<0.05),与同时期花瓣中萜烯类香气物质的含量变化规律一致。【结论】本研究成功克隆了华中樱PcoPMK基因,初步推测其可能在花瓣萜烯类物质合成途径中发挥重要作用,为进一步研究该基因的生物学功能提供了参考。

米曲霉磷酸甲羟戊酸激酶功能研究

磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)是甲羟戊酸(MVA)途径的关键酶。在真菌中,MVA途径是麦角甾醇生物合成的上游,因此PMK也被称为Erg8。为了研究磷酸甲羟戊酸激酶在米曲霉(Aspergillus oryzae)麦角甾醇合成通路中的作用,对米曲霉AoErg8基因功能进行研究。采用生物信息学方法鉴定米曲霉中的该基因,通过系统发育树和酵母异源互补分析其是否保守,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其表达模式,同时通过荧光蛋白标记对其亚细胞定位进行分析,最后测定AoErg8基因过表达对米曲霉生长和麦角甾醇含量的影响。结果表明,AoErg8进化保守,其表达量在不同生长时间和不同非生物胁迫下均发生了改变;AoErg8能恢复酿酒酵母erg8突变体的温度敏感表型;AoErg8定位于细胞质中;米曲霉中AoErg8过表达导致麦角甾醇含量降低,并且影响米曲霉生长和孢子形成。因此,米曲霉Ao Erg8的功能相对保守,其过表达可以降低麦角甾醇含量并影响菌落生长和孢子形成。该研究进一步揭示丝状真菌米曲霉麦角甾醇生物合成和调控机理,为米曲霉或其他真菌脂质代谢的基因工程奠定基础。

茶树甲羟戊酸激酶基因CsMVK克隆及表达特性分析

【目的】克隆茶树甲羟戊酸激酶基因(Cs MVK),分析其生物学信息及在不同组织及乌龙茶做青过程中的表达特性,为研究茶叶加工过程中香气形成机制提供参考。【方法】RT-PCR扩增Cs MVK基因,应用生物信息学软件对其编码蛋白(Cs MVK)的氨基酸序列进行预测分析,通过实时荧光定量PCR(q PCR)分析Cs MVK在茶树不同组织及乌龙茶做青过程中的表达特性。【结果】克隆获得的Cs MVK基因(Gen Bank登录号MF668187)全长1455 bp,开放阅读框(ORF)长度为1164 bp,编码387个氨基酸,蛋白质分子量41.18 k D,理论等电点(p I)5.88。Cs MVK蛋白具有GHMP_kinases_N domain和GHMP_kinases_C domain 2个功能结构域,定位于细胞质中,不存在跨膜结构和信号肽。系统发育进化树分析结果显示,Cs MVK与三七、常春藤的MVK聚为一类,表明茶树与三七、常春藤的亲缘关系最近。q PCR检测结果显示,Cs MVK基因在果实中的表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),在不同组织中的表达量排序为:果实>根>叶>茎>花;在乌龙茶做青过程中,从鲜叶到晒青叶,Cs MVK基因的表达量上升,晒青到一摇过程中表达量下降,经过3次摇青,其表达量持续升高并在杀青前达最大值,与其他做青阶段差异显著。【结论】Cs MVK基因表达与茶叶香气品质形成有关。

滇龙胆甲羟戊酸激酶基因的克隆与表达分析

甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径的关键酶。根据滇龙胆转录组甲羟戊酸激酶基因Gr MK序列,设计一对基因特异性引物克隆该基因,并进行序列分析;构建原核表达载体p GEX-4T-1-Gr MK,转入大肠杆菌Rosetta(DE3),重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下成功表达。生物信息学分析结果表明,Gr MK蛋白为甲羟戊酸激酶家族成员,具有MK蛋白保守结构域:乳糖激酶/高丝氨酸激酶/甲羟戊酸激酶/磷酸甲羟戊酸激酶(GHMP kinase)N端结构域、C端结构域和ATP结合结构域;Gr MK与长春花Cr MK亲缘关系最近.原核表达结果表明,融合蛋白相对分子质量与推断大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr MK基因主要在根中表达.这些结果为Gr MK蛋白结构和功能的研究奠定基础。

甲羟戊酸激酶基因研究进展

类异戊二烯是维持生物生长发育等所必需的重要有机物质,包括甾醇、长萜醇、辅酶Q、叶绿素和生长调节剂等多种重要物质,是通过甲羟戊酸代谢途径的一系列酶酶促反应合成的。综述了该途径中的限速酶之一甲羟戊酸激酶的生物学特性、基因克隆及表达等方面的研究进展,旨在为其病虫害控制、动植物改良中的应用提供依据。

甲羟戊酸激酶基因真核及shRNA表达载体构建及其对BxPC-3细胞周期蛋白表达的影响

目的 构建甲羟戊酸激酶（MVK）基因真核及shRNA表达载体并转染至BxPC-3细胞中,观察其对细胞周期蛋白的影响。方法 从BxPC-3细胞中提取总RNA,逆转录PCR（RT-PCR）法获得目的基因MVK以及通过化学合成MVK（751~779）和MVK（1089~1117）位点寡核苷酸片段,构建真核表达及shRNA表达载体并转染至BxPC-3细胞,筛选稳定表达细胞系。Westernblot法分析转染后对BxPC-3细胞周期蛋白的影响。结果 成功获得MVK基因真核表达（pcD-NA3.1-mvk）及两个针对MVK shRNA表达载体（piLenti-RNAi-shRNA1/2）。通过抗生素筛选及Westernblot分析获得了稳定的MVK过表达及低表达细胞株。Westernblot分析显示：过表达MVK的细胞株及MVK knockdown的细胞株中细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinE表达量与正常及对照细胞相比均显著降低。结论 MVK过表达及低表达均抑制Bx-PC-3细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E的表达。

杜仲甲羟戊酸激酶(EuMK)基因鉴定及生物信息学分析

甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MK)是萜类化合物生物合成甲羟戊酸(mevalonate pathway,MVA)途径的限速酶之一。为了探明EuMK对杜仲胶生物合成的调控机制,对EuMK所编码蛋白质氨基酸序列的理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二、三级结构、结构保守域以及基因组内含子和外显子结构特征等进行了全面的生物信息学分析,结果发现EuMK蛋白质序列均存在3个与甲羟戊酸底物结合及催化反应有关的保守结构域;EuMK的氨基酸组成中性的疏水性蛋白居多数,属于稳定的疏水性蛋白;无明显的跨膜结构,均在膜外;二级结构为混合型结构的蛋白质。EuMK均含有4个外显子,3个内含子;EuMK基因家族启动子顺式作用元件潜在功能的预测分析发现,含有大量基本顺式作用元件TATAbox,CAATbox,还含有光(AE-box、CGT-motif、Box 4、G-box)、生长素(ERE、ABRE、TCA-element)响应等多个顺式调控元件。

青天葵甲羟戊酸激酶基因的编码蛋白预测和表达分析

甲羟戊酸途径(mevalonic acid,MVA)是植物三萜类化合物生物合成的主要途径,而甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MVK)是MVA途径中的关键限速酶之一。根据前期获得的青天葵[Nervilia fordii(Hance)Schltr.]转录组数据,采用生物信息学方法对青天葵MVK基因编码蛋白的理化特性、功能结构域、二级结构、信号肽、跨膜结构域等进行预测,并采用RPKM法分析该基因在青天葵球茎和叶片的表达量。结果表明,Nf MVK基因编码含有383个氨基酸的稳定型亲水性、酸性蛋白质,与其他植物MVK蛋白同源性可达70%。Nf MVK蛋白分子量为41.29 ku,含有甲羟戊酸激酶功能域,归属于GHMP_Kinase超级家族。该蛋白没有任何信号肽、转运肽和跨膜结构域,二级结构为混合型结构的蛋白质。Nf MVK基因在青天葵中的表达趋势为:球茎>叶片。该结果可为后续利用MVK基因调控青天葵三萜类活性成分的合成提供理论依据。

鸭疫里默氏菌甲羟戊酸激酶基因的重组表达与免疫保护效果研究

在从鸭疫里默氏菌(RA)基因组文库筛选毒力基因的过程中,作者获得了编码RA甲羟戊酸激酶的基因(RAMVA),将该基因片段提交GenBank,收录号为GQ398751。测序分析结果显示其开放阅读框长492 bp,共编码163个氨基酸。根据序列信息设计引物,用PCR方法从RA中扩增出RAMVA的编码区并与表达质粒pMAL-C2X连接,构建重组质粒pMAL-RAMVA。经限制性酶切和序列测序鉴定序列正确无误后将pMAL-RAMVA转化至E.coliBL21(DE3)构建重组表达菌E.coliBL21/pMAL-C2X-RAMVA。用IPTG诱导重组菌成功诱导RAMVA的表达,通过SDS-PAGE分析表达产物,表达量占全菌总蛋白的15.6%,且重组表达的甲羟戊酸激酶在大肠杆菌中表达时以可溶性状态存在。雏鸭免疫试验表明,接种重组表达菌E.coliBL21/pMAL-C2X-RAMVA2周后,可产生对RA致死量攻击达42.3%的免疫保护率。

植物甲羟戊酸激酶基因研究进展

类异戊二烯是维持植物生长发育、光合作用等所必需的重要有机物质,包括叶绿素、生长调节剂等多种重要物质,是通过甲羟戊酸代谢途径中一系列酶促反应合成的。本文综述了该途径中的限速酶之一甲羟戊酸激酶的生物学特性、酶促反应机理、基因克隆、基因转化等方面的研究进展,旨在为其在作物改良中的应用提供依据。

茉莉花磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及表达分析

【目的】克隆茉莉花磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)基因(JsPMK),对其进行生物信息学分析并检测其表达时间节律性,为深入研究茉莉花萜类化合物生物合成途径及其调控机制提供理论参考。【方法】以茉莉花花瓣为材料,采用RT-PCR扩增JsPMK基因全长,利用生物信息学软件对其编码蛋白进行预测分析,并采用qRT-PCR检测JsPMK基因在茉莉花开放过程中的表达情况。【结果】克隆获得的JsPMK基因(GenBank登录号为MH311042)全长1951 bp,包含1518 bp完整的开放阅读框(ORF),共编码505个氨基酸,其编码蛋白定位于细胞质,为稳定的非分泌蛋白。JsPMK蛋白含有GHMP激酶N端保守区和C端保守区,且在N端保守区含一个ATP结合位点Gly-X-Gly-XX-Ala。JsPMK蛋白与野生油橄榄、芝麻、丹参和番茄的PMK蛋白氨基酸序列相似性均较高(在80%以上),其中与野生油橄榄亲缘性最近,表明不同植物PMK蛋白高度保守。JsPMK基因在未开放(18∶00)时表达量最低,随着茉莉花逐渐开放,JsPMK基因表达量极显著上升(P<0.01,下同),在20∶00达最大值,随后表达量极显著下降。【结论】JsPMK基因表达可能受生物钟调控,在茉莉花萜类化合物合成和香气释放中发挥重要的调控作用。

阳春砂磷酸甲羟戊酸激酶的基因克隆与表达谱分析

目的：为了了解阳春砂磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）的功能与表达特性，根据阳春砂的转录组注释设计引物，PCR 克隆阳春砂甲羟戊酸途径中的关键酶磷酸甲羟戊酸激酶基因的编码区 cDNA，使用生物信息学方法对其编码的蛋白进行相似性检索及同源序列比对，构建进化树，预测二级及三级结构并分析其功能，探索其各器官中的表达差异．结果：获得了全长1539 bp 的编码阳春砂 PMK 的 cDNA 序列，命名为 AvPMK （GenBank 登录号：KF569902），编码由512个氨基酸组成的磷酸甲羟戊酸激酶，该蛋白含有 GHMP 激酶超家族特异的 N －保守区域、C －保守区域和 ATP 结合位点 Gly-X-Gly-XX-Ala．AvPMK 与其他植物的 PMK 氨基酸相似性达61％～69％，进化树结果显示其与二穗短柄草（Brachypodium distachyon）等单子叶植物具有较近的亲缘关系．AvPMK 蛋白包含14个α-螺旋（Alpha helix），占37.1％；16个β链（Beta strand），占15.6％；32个无规则卷曲结构，占47.3％，无跨膜结构域，其3级结构含有一个催化反应的口袋状结构域．实时荧光定量 PCR 结果显示 AvPMK 基因在叶中表达量较高，茎、根中表达量相对较低．结论：首次从阳春砂仁中扩增磷酸甲羟戊酸激酶的基因片段，为分析其基因表达特性及其在砂仁萜类生物合成中的功能奠定基础．

暗紫贝母甲羟戊酸激酶基因的重组表达与定点突变研究

目的研究暗紫贝母Fritillaria unibracteata甲羟戊酸激酶(FUMK)基因的重组表达与定点突变。方法基于暗紫贝母转录组中FUMK基因的ORF序列,全化学合成FUMK-pET28a重组质粒,在大肠杆菌BL21中表达其重组蛋白,纯化后检测其酶活性。利用定点突变验证关键氨基酸。结果FUMK基因ORF全长为1158 bp,编码一条长度为385个氨基酸的多肽。FUMK与卷叶贝母的甲羟戊酸激酶(MK)同源性最高,序列相似性可达77.14%。FUMK与百合科贝母属植物的MK聚类形成单系群,具有最近的亲缘关系。在大肠杆菌BL21中成功表达出FUMK重组蛋白,纯化后的重组蛋白能够催化腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)与甲羟戊酸反应,形成甲羟戊酸磷酸。FUMK对ATP的酶促反应最大速度(Vmax)与米氏常数(Km)值分别为1.72μmol·min^(-1)·mg^(-1)、15.84μmol·L^(-1);对甲羟戊酸的Vmax与Km值分别为0.71μmol·min^(-1)·mg-1、28.58μmol·L^(-1)。His198Ala和Ser137Ala两种突变蛋白的酶促活性分别显著减少49.08%、23.91%,表明其是FUMK行使催化功能的关键氨基酸残基。结论成功鉴定了FUMK基因,并验证了His198与Ser137两个关键氨基酸残基,为研究其基因在暗紫贝母甾体类生物碱生物合成途径中的生物学作用奠定了理论基础。

蛹虫草磷酸甲羟戊酸激酶和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的功能分析

【目的】确定蛹虫草甲羟戊酸途径中的2个关键酶——磷酸甲羟戊酸激酶(CmErg8)和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(CmErg19)的功能及其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【方法】通过生物信息学分析鉴定蛹虫草中CmErg8和CmErg19,并采用酵母互补确定其功能是否保守;以蛹虫草尿嘧啶营养缺陷型CmΔpyrG为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对CmErg8和CmErg19进行过表达,观察其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【结果】CmErg8和CmErg19不能互补酵母erg8和erg19突变体的温度敏感表型;CmErg8和CmErg19过表达菌株中麦角甾醇和虫草素含量均有所增加,特别是CmErg19基因过表达可以使虫草素含量提升5倍左右。【结论】本研究揭示了蛹虫草CmErg8和CmErg19的功能,并且发现蛹虫草麦角甾醇合成通路基因可能会影响虫草素含量。

暴马桑黄甲羟戊酸激酶基因的克隆及差异表达分析

为研究暴马桑黄(Sanghuangporus baumii)三萜合成途径的调控机制,对该途径中的关键酶——甲羟戊酸激酶(Mevalonate kinase,MVK)基因进行克隆及差异表达分析。以暴马桑黄cDNA为模板,采用同源克隆得到MVK基因cDNA序列全长,命名为SbMVK(登录号为MN793978)。生物信息学分析显示,SbMVK基因cDNA序列长1041 bp,编码346个氨基酸,蛋白分子量为36.6 ku,属于GHMP kinase超家族成员;系统进化树结果表明,暴马桑黄MVK蛋白和紫芝MVK蛋白同源性最高。采用qRT-PCR技术对暴马桑黄不同发育阶段SbMVK基因进行转录水平分析,并对相应阶段的三萜进行提取和含量测定,结果表明:暴马桑黄SbMVK基因转录水平和三萜含量均先升后降,并且二者变化趋势基本一致,推测SbMVK基因在暴马桑黄甲羟戊酸途径中参与三萜调控工作,此研究结果可为深入了解该基因在暴马桑黄三萜合成中的功能及获得高三萜产量的菌株提供理论依据。

独行菜磷酸甲羟戊酸激酶LaPMK基因克隆、生物信息学分析及原核表达

目的从独行菜Lepidium apetalum中克隆萜类合成途径关键酶磷酸甲羟戊酸激酶(phosphomevalonate kinase,PMK)基因,进行序列分析和原核表达。方法根据独行菜转录组数据中La PMK基因序列设计特异性引物,克隆得到La PMK基因的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建p ET32a-La PMK原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达La PMK融合蛋白。结果 La PMK基因ORF全长为1 518 bp(Genbank注册号KT004541),编码505个氨基酸。生物信息学分析结果显示La PMK蛋白没有跨膜区,不含信号肽,位于细胞质中,含有GHMP激酶家族特异的N末端和C末端的保守结构域。系统进化树结果显示La PMK蛋白与芜菁的PMK蛋白具有92%的序列相似性,亲缘关系较近。构建p ET32a-La PMK原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达La PMK融合蛋白。结论克隆了La PMK基因,建立其稳定的原核表达体系,为La PMK蛋白纯化、抗体的制备,进一步研究La PMK基因在独行菜萜类合成途径中的作用奠定了基础。

野生烟草甲羟戊酸激酶NsyMK基因克隆与序列分析

甲羟戊酸激酶是植物中控制整个甲羟戊酸途径重要的限速酶,其代谢产物萜类物质是烟草芳香物质的主要来源。本研究采用同源克隆,利用RACE方法获得二倍体林烟草(Nicotiana sylvestris)甲羟戊酸激酶(NsyMK)的开放阅读框序列,对NsyMK序列进行生物信息学分析,预测蛋白理化性质、二级结构、三维结构并推测其结构与功能。结果表明,克隆获得的林烟草NsyMK的开放阅读框全长为1158bp,编码385个氨基酸,预测分子量41.4kDa、等电点为6.05,GenBank登录号KC871597。蛋白质结构分析显示NsyMK存在典型GHMP激酶和甲羟戊酸激酶保守结构域。生物信息学预测NsyMK蛋白不含跨膜区与信号肽。本研究成功克隆并分析了一个未报道的林烟草NsyMK的全长序列,为进一步阐明栽培烟草中萜类代谢途径奠定基础。

甲羟戊酸激酶缺乏症

甲羟戊酸激酶缺乏症(MKD)是一种罕见的自身炎症性疾病,属常染色体隐性遗传病。根据甲羟戊酸激酶(MVK)活性和临床表现不同,MKD又分高Ig D伴周期性发热综合征(HIDS)和甲羟戊酸尿症(MA)两种亚型。文章系统阐述MKD发病机制、临床表现、诊断标准、治疗原则及预后,以提高临床医生对疾病的认识。

三七甲羟戊酸激酶PnMVK1基因的克隆和生物信息学分析

药用植物三七通过甲羟戊酸途径(mevalonic acid pathway)合成三萜皂苷生物合成的前体。甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MVK)则是甲羟戊酸合成途径中ATP依赖的限速酶之一。本研究根据课题组已获得的三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]转录组数据中的MVK1转录本序列,利用RT-PCR方法获得三七MVK1(PnMVK1)基因的全长cDNA序列;对PnMVK1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测了该蛋白的结构与功能;利用实时荧光定量PCR方法检测了PnMVK1基因在三七的根、茎、叶、花中的表达情况。序列分析表明,克隆获得的三七PnMVK1基因长为1 164 bp,编码387个氨基酸,GenBank登录号JQ957844。生物信息学预测PnMVK1蛋白不含跨膜区,不含信号肽,具有GHMP激酶等保守结构域。PnMVK1基因在三七的根中表达丰度最高。本研究成功克隆并分析了三七MVK1的全长序列,为进一步阐明三七三萜代谢途径奠定基础。

一例甲羟戊酸激酶缺乏导致的高IgD综合征患儿的MVK基因变异分析

目的探讨甲羟戊酸激酶缺乏症的临床表型及遗传学特点,明确其可能的致病原因。方法应用高通量测序进行trio全外显子组测序。应用Sanger测序对检出的变异进行验证。结果测序结果显示患儿MVK基因存在c.248C>T(p.Phe83Cys)和c.971C>T(p.Ala324Val)复合杂合变异,父亲携带c.248C>T(p.Phe83Cys)杂合杂合变异,母亲携带c.971C>T(p.Ala324Val)杂合变异,2个变异均未见报道。根据根据美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南,这2个变异均判定为可能致病变异(PM1+PM2+PM3+PP3)。结论MVK基因c.248C>T(p.Phe83Cys)和c.971C>T(p.Ala324Val)复合杂合变异可能为患儿的致病原因,新变异的检出丰富了MVK基因变异谱。