茶树甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因CsMVD的克隆与表达分析

该研究在茶树转录组测序的基础上,以茶树品种‘福鼎大白茶’的芽叶为供试材料,采用RT-PCR技术,克隆茶树萜类化合物合成途径中的限速酶——甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶全长cDNA序列,命名为CsMVD(GenBank登录号为MF772780);该基因全长1 585bp,其ORF为1 266bp,编码421个氨基酸,蛋白质分子量46.45kD,理论等电点7.10。CsMVD蛋白可能定位于细胞质中,具有MVD1superfamily的保守结构域,不存在跨膜结构和信号肽,具有多个磷酸化位点,部分保守的氨基酸残基决定了蛋白的催化反应特异性和活性。系统进化分析表明,CsMVD与新疆紫草(Arnebia euchroma)MVD的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,CsMVD在茶树不同组织中均有表达,果实中CsMVD的表达量最高,表达水平表现为:果实>茎>根>叶>花;在白茶萎凋过程中,CsMVD基因的表达量在48h结束阶段显著高于0h,推测该基因与茶叶萜类香气化合物形成有关。

洋常春藤甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因HhMVD的克隆与表达分析

甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Mevalonate diphosphate decarboxylase,MVD)是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶,为研究其在洋常春藤中的基因功能,通过RT-PCR和RACE技术从洋常春藤叶片中克隆获得HhMVD基因的cDNA全长序列,并通过RT-qPCR技术分析其表达规律。结果表明:RACE克隆获得的HhMVD基因cDNA序列全长1 799 bp,包含一个完整开放阅读框(ORF)1 263 bp、5′非编码区(5′UTR)192 bp、3′非编码区(3′UTR)344 bp;该基因编码420个氨基酸,分子质量46.6ku,理论等电点为6.57,不含跨膜区,属于非分泌型蛋白;HhMVD蛋白具有GHMP激酶N端结构域,属于甲羟戊酸激酶系列,与刺五加、人参、三七等同科植物亲缘关系较近。RT-qPCR结果表明,洋常春藤中HhMVD基因的时空表达相对稳定,但与常春藤皂苷含量差异变化之间存在一定的负相关性。洋常春藤HhMVD基因的成功克隆及表达分析研究,为深入探讨其基因功能、阐明其在常春藤皂苷生物合成途径中的作用提供理论依据。

甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶及其抑制研究进展

甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶(MDD)是甲羟戊酸途径中的一种重要的酶,它在调节胆固醇等类异戊二烯化合物的生物合成方面起重要作用,有可能成为治疗心血管疾病和癌症的靶标。该文总结了MDD在催化机理、蛋白结构、序列对比分析与残基功能,及其抑制剂研究等方面的成果。

滇龙胆甲羟戊酸二磷酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

为获得滇龙胆GrMDC基因序列,以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆GrMDC基因,并进行原核表达和组织特异性表达分析。结果表明:滇龙胆GrMDC基因(登录号KJ917169)全长1 275bp,GrMDC蛋白相对分子量为46.77kD,pI为5.97;该蛋白可能定位于细胞质,无信号肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;GrMDC蛋白与长春花CrMDC蛋白相似性较高(88.12%),且亲缘关系最近;GrMDC基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为72.77kD(含GST标签26kD),与预期蛋白大小一致;GrMDC基因主要在根中表达。

蛹虫草磷酸甲羟戊酸激酶和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的功能分析

【目的】确定蛹虫草甲羟戊酸途径中的2个关键酶——磷酸甲羟戊酸激酶(CmErg8)和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(CmErg19)的功能及其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【方法】通过生物信息学分析鉴定蛹虫草中CmErg8和CmErg19,并采用酵母互补确定其功能是否保守;以蛹虫草尿嘧啶营养缺陷型CmΔpyrG为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对CmErg8和CmErg19进行过表达,观察其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【结果】CmErg8和CmErg19不能互补酵母erg8和erg19突变体的温度敏感表型;CmErg8和CmErg19过表达菌株中麦角甾醇和虫草素含量均有所增加,特别是CmErg19基因过表达可以使虫草素含量提升5倍左右。【结论】本研究揭示了蛹虫草CmErg8和CmErg19的功能,并且发现蛹虫草麦角甾醇合成通路基因可能会影响虫草素含量。

金钗石斛焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的克隆及表达分析

焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶（pyrophospomevalonate decarboxylase,MVD）是甲羟戊酸途径中的关键酶,在植物细胞萜类物质合成代谢过程中发挥着重要的作用。石斛碱作为倍半萜类生物碱,其合成很可能离不开MVD的参与。本研究利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（RACE）技术,首次从金钗石斛中克隆到一个MVD基因,命名为DnMVD（GenBank注册号KY626328）。DnMVD基因cDNA全长1 763 bp,编码一条由424个氨基酸组成的多肽,分子量为47.132 63 kD,等电点6.84。DnMVD编码的蛋白包含GHMP激酶超家族的特异性识别序列,且拥有严格保守的1个亮氨酸、1个天冬氨酸和3个半胱氨酸活性位点,与多种植物MVD高度同源。DnMVD的表达受到菌根真菌的影响,金钗石斛茎中DnMVD的表达量于接菌后期显著高于对照。DnMVD基因的分子鉴定及其在接菌前后金钗石斛茎中的表达特性为进一步解析该基因在金钗石斛石斛碱合成代谢途径及菌根互作过程中的分子调控作用奠定了重要的基础。

牛樟芝菌丝体和子实体三萜含量测定及Se和Mvd基因表达分析

为探讨牛樟芝子实体和不同培养时期的菌丝体中三萜含量及鲨烯环氧酶基因（Se）和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因（Mvd）的表达情况,采用香草醛-冰醋酸法测定菌丝体和子实体的三萜含量,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析甲羟戊酸途径（MVA）中Se和Mvd基因表达水平。结果表明,随着培养时间的推移,当生长至21 d时牛樟芝菌丝体干重逐渐趋于稳定。当培养时间小于28 d时,菌丝体中三萜含量随着培养时间的延长而逐渐增加,且28 d时菌丝体的三萜含量最高,达（39.192±2.025）mg/g,仅次于牛樟芝子实体三萜含量（49.391±2.675）mg/g,玉米芯栽培的牛樟芝子实体三萜含量最低,为（11.530±0.733）mg/g,各样品间三萜含量差异达到显著水平（P〈0.05）。qRT-PCR分析结果表明,培养7 d的菌丝体中Se和Mvd的表达量均为最高,但随着培养时间的继续延长而呈现下降趋势;牛樟芝子实体中Se和Mvd的表达量均较低,与培养28-42 d的菌丝体表达量相当。本研究结果表明牛樟芝的三萜含量可能与其合成途径中相关基因的表达量、培养条件和累积时间有关。

茉莉花MVD基因及其启动子的克隆与表达

根据茉莉花转录组数据,采用RT-PCR技术,克隆了茉莉花甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD)基因,命名为JsMVD(GenBank登录号为MH311041.1).采用染色体步移技术分离JsMVD基因5′端上游调控序列,通过实时荧光定量PCR技术检测JsMVD基因在茉莉花植株不同组织及不同激素处理下的表达水平.测序结果表明,JsMVD基因全长cDNA序列的长度为1 500 bp,包含长度为1 269 bp的开放阅读框(ORF),共编码422个氨基酸,亚细胞定位预测该蛋白可能位于细胞质上.JsMVD蛋白含有GHMP激酶N-端和C-端保守结构域,具有多个保守氨基酸残基及ATP结合位点,与野生油橄榄的相似性最高,相似系数达到88%,且进化树显示两者的亲缘关系最近.JsMVD基因5′端启动子序列长度为893 bp,该调控序列包含多种植物激素响应元件和光响应元件.实时荧光定量PCR技术检测结果表明,JsMVD基因在成熟花中的表达量最高,从高到低依次为成熟花、花蕾、茎、叶、根,且受GA、IAA和ABA不同程度的诱导.

磷甘霉素和洛伐它汀处理对中国红豆杉悬浮培养细胞生物合成紫杉醇的影响

采用非甲羟戊酸途径抑制剂磷甘霉素和甲羟戊酸途径抑制剂洛伐它汀对中国红豆杉悬浮细胞培养物进行处理。在添加和未添加茉莉酸甲酯诱导的情况下,前者使紫杉醇产量减少了2/5和1/5,后者使紫杉醇产量减少了1/6和1/10,表明两种途径对紫杉醇的生物合成都具有贡献,其中非甲羟戊酸途径贡献较大;通过定量PCR技术分别检测两条途径的关键酶5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)mRNA水平的变化,发现两种抑制剂都能够激活hmgr和dxr的转录,表明两种代谢途径之间存在协同作用,共同为紫杉醇的生物合成提供前体。

Pravastatin抑制心肌成纤维细胞胶原基因表达及其机制研究

目的探讨pravastatin(Prav)对血管紧张素Ⅱ(angiotensionⅡ,AngⅡ)诱导的Wistar大鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CF)胶原基因表达及其作用机制。方法取1～3日龄Wistar大鼠心室,以酶消化法分离培养大鼠CF。用MTT法测定细胞增殖,RT-PCR方法测定Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因(PⅠCP、PCⅢ)表达。将CF分为:(1)空白对照组(A组):不加干预药物;(2)AngⅡ组(B组):AngⅡ10-6 mol/L;(3)Prav+AngⅡ组:在加入AngⅡ10-6 mol/L基础上再分别加入Prav 10-6、10-5、10-4mol/L,分别为C、D、E组;(4)Prav 10-4 mol/L+AngⅡ10-6 mol/L+甲羟戊酸(MVA)10-4 mol/L组(F组);(5)Prav 10-4mol/L+AngⅡ10-6 mol/L+焦磷酸牛龙牛儿基牛龙牛儿酯(GGPP)10-5 mol/L组(G组);(6)Prav 10-4 mol/L+AngⅡ10-6mol/L+焦磷酸法呢酯(FPP)10-5 mol/L组(H组)。结果 Prav呈浓度依赖性的抑制AngⅡ刺激下的CF增殖(P<0.01)。F、G组可完全阻断Prav的抑制作用,与E组比较差异有统计学意义(P<0.01)。H组对Prav的作用无影响(P>0.05)。结论 Prav主要通过抑制甲羟戊酸途径减少成纤维细胞增殖和胶原基因的表达,减缓心肌纤维化过程。

丙酮酸脱羧酶及其应用研究

丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC),EC4.1.1.1,是一种胞内酶,是焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate,ThPP)依赖性的非氧化酶,是由辅酶ThPP、Mg2+和蛋白质构成的全酶,在辅助因子焦磷酸硫胺素和Mg2+参与下作用于丙酮酸而产生乙醛和CO2。PDC是丙酮酸合成乙醇的关键酶。它广泛存在于酵母菌、霉菌、细菌和植物等多种生物体中,不同来源的丙酮酸脱羧酶的结构、相对分子质量、酶学性质等均不尽相同。该文综述了丙酮酸脱羧酶生物学性质及其应用前景。

O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯的合成与生物活性

丙酮酸脱氢酶系（PDHc）属于焦磷酸硫胺素（TPP）依赖性酶,是一个具有重要农学意义的农药作用靶标。以微生物中的丙酮酸脱羧酶E1（PDHc E1）为靶标,设计合成TPP类似物有望发现新型的杀菌活性化合物。以三唑环代替TPP结构中的噻唑环,以异硫氰酸酯结构单元替代TPP结构中的焦磷酸结构单元,设计合成了O-[1-（2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基）-1 H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯类系列化合物Ⅰa~Ⅰj,采用IR、1 HNMR、MS和元素分析对Ⅰa~Ⅰj进行了结构表征,部分化合物还经13 CNMR进一步进行了结构表征。结果表明,此类化合物不仅为大肠杆菌丙酮酸脱羧酶E1（PDHc E1）的抑制剂,而且还显示了杀菌活性。

两个棉纤维发育相关基因的克隆与特征分析(英文)

棉纤维发育突变体是克隆棉纤维发育关键基因和阐明其发育分子机理的优异资源。陆地棉李氏超短纤维突变体(Li1li1)是显性单基因突变体,表现为显性纯合体(Li1Li1)致死,显性杂合时(Li1li1)表型为茎秆扭曲、叶片卷曲和纤维短至6mm,而隐性纯合体(li1li1)则表现为株型和纤维发育都正常。本文对开花后10d的李氏纤维发育正常材料(li1li1)和超短纤维突变体(Li1li1)胚珠纤维混合体进行mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析,获得2条在李氏纤维发育正常材料中上调表达的差异片段。测序及DNA序列的生物信息学分析表明该差异片段分别与编码谷氨酸脱羧酶和质子焦磷酸酶的基因有较高同源性。通过电子拼接,5′RACE和全长cDNA序列验证,克隆了棉花的谷氨酸脱羧酶(GhGAD)和质子焦磷酸酶(GhVP1)基因全长cDNA,进一步对其功能和染色体定位进行了初步分析。转录水平分析表明,这两个基因在棉花根、茎、叶和纤维中组成性表达,在棉纤维中优势表达。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC1作图群体,将GhGAD和GhVP1分别定位在第12条染色体和第8条染色体。

提高酿酒酵母异戊二烯产量的代谢途径的挖掘

以酿酒酵母为宿主菌株,挖掘可以提高异戊二烯产量的新的基因改造策略。该研究通过敲除线粒体丙酮酸载体(MPC2)、线粒体孔蛋白(POR2)和丙酮酸脱氢酶复合体的E1α亚基(PDA1)基因来增加细胞质乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)的通量,并将含有白杨(Populus alba)异戊二烯合酶基因的质粒pESC-His-ispS分别转入以上3个敲除体,得到工程菌SC1、SC2和SC3。通过摇瓶发酵,SC3效果最优,比原始菌株提高了0. 3倍。为了进一步增加Acetyl-CoA在胞质中的通量,以△PDA1菌株作为基础,进一步引入并过表达了来自Leuconostoc mesenteroide和Clostridium kluyveri的木酮糖-5-磷酸特异性磷酸转酮酶基因(xylulose-5-phosphate-specific phosphoketolase)(LmPK)和磷酸转乙酰酶基因(phosphotransacetylase)(CkPTA)得到SC4,将质粒pESC-His-ispS转入SC4,得到工程菌pHB1。然后将含有大肠杆菌异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase)(IDI1)的质粒pESC-His-ispS-EcIDI1转入SC4,获得pHB2。摇瓶发酵结果表明,产量达到了54μg/L,比原始菌株提高了约1倍。该研究为后续异戊二烯的研究提供了新的研究思路,也为利用酵母规模化生产异戊二烯的奠定了重要基础。

暴马桑黄MVD基因cDNA全长克隆及表达特性分析

【目的】对暴马桑黄中参与三萜合成途径的关键酶——甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD)基因进行克隆及表达特性分析,以了解暴马桑黄三萜合成的调控机制。【方法】利用生物信息学软件对MVD基因cDNA序列进行分析,并采取同源重组方法构建原核表达载体。用qRT-PCR技术分析MVD基因在暴马桑黄不同发育阶段表达特性;以分光光度计法测定暴马桑黄在不同发育阶段的三萜含量和变化规律。【结果】暴马桑黄MVD基因cDNA序列全长1209 bp,编码402个氨基酸,相对分子质量为43.43 ku,命名为SbMVD(登录号为MK977617)。系统进化树表明:暴马桑黄MVD蛋白和紫芝、灰树花MVD蛋白同源性最高。SDS-PAGE结果显示:在65 ku(包含21 ku标签蛋白)附近出现与预期大小一致的目的蛋白条带。qRT-PCR分析及三萜含量测定结果表明:暴马桑黄SbMVD基因转录水平和三萜含量在不同发育阶段呈先升后降的变化趋势,并且两者变化趋势基本一致。【结论】通过对SbMVD基因的克隆及表达特性分析,推测该基因在三萜合成途径中发挥一定作用,为进一步研究该基因在暴马桑黄三萜合成过程中的功能奠定了基础。

不同产地桔梗皂苷生物合成与土壤元素关系的研究

目的 研究桔梗皂苷积累与土壤元素的关系,从基因表达水平明确不同产地桔梗皂苷含量差异的原因,为桔梗药材的科学种植提供理论依据。方法 利用HPLC法和香草醛-冰醋酸比色法测定不同产地桔梗韧皮部和木质部的桔梗皂苷D和桔梗总皂苷含量,实时荧光定量PCR测定6种关键酶基因的表达量,利用原子吸收法、比色法等方法测定土壤元素含量,用Pearson相关性分析法分析土壤元素与桔梗皂苷及其关键酶基因表达量的关系。结果 河南洛阳产桔梗根中的桔梗皂苷D和桔梗总皂苷含量显著高于其他产地,桔梗韧皮部和木质部的桔梗皂苷含量和关键酶基因表达量存在较大差异;相关性分析表明,土壤中Cu、Ca和Zn含量对桔梗皂苷的合成起主要作用,甲羟戊酸焦P酸脱羧酶基因、法尼基焦P酸合酶基因和异戊烯基焦P酸异构酶基因是桔梗皂苷合成过程中的主要关键酶基因,土壤元素对桔梗关键酶基因具有一定的调控作用。结论 土壤元素通过调控关键酶基因进而影响桔梗皂苷的合成,其中土壤中Zn含量起主要作用。