甲醇营养型酵母表达系统的研究进展

甲醇营养型酵母越来越被人们用作外源基因的表达系统。本文综述其在表达质粒构建，表达株的筛选，表达产物的糖链加工以及它分拣外源蛋白进入过氧化物酶体等的特点，不仅具有广泛的商业用途，而且在理论研究特别是膜蛋白结构与功能方面也有潜在应用价值。

SARS-CoV S1蛋白在甲醇营养型酵母中表达及鉴定

目的获得保持生物学活性、易于纯化、高产量的严重急性呼吸道综合征冠状病毒(severe acute resp iratorysyndrom coronavirus,SARS-CoV)S1蛋白,以便进一步研究S1蛋白及其抗体的功能。方法将SARS-CoV S1基因重组入酵母表达载体pMETαA,经过酶切和测序鉴定后,通过电穿孔法将重组质粒S1-pMETαA转化入宿主酵母菌株PMAD11,使其在甲醇的诱导下表达目的蛋白。最后用覆盖分析法对重组转化子初步分析,SDS-PAGE和W esntern b lotting法鉴定目的蛋白的表达和特异性。结果酶切鉴定和测序结果证实了S1基因成功地克隆到pMETαA载体中;覆盖分析、SDS-PAGE和免疫印迹法证实S1基因得到正确的表达。结论利用酵母表达系统,成功地克隆和表达了SARS-CoV S1蛋白,为进一步纯化该蛋白和研究其功能奠定了基础。

人胰岛素样生长因子Ⅱ在甲醇营养型酵母P.pastoris中的表达、分泌和性质研究

为获得ＩＧＦ－Ⅱ的高效表达，构建了其多拷贝、分泌型表达载体：含有５个串联的ＩＧＦ－Ⅱ表达单元；由受甲醇诱导的醇氧化酶启动子控制表达；利用啤酒酵母α因子的前导肽引导分泌．线形化表达载体转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ蛋白酶缺陷型菌株后，筛选到有ＩＧＦ－Ⅱ表达和分泌的阳性转化子；进一步优化表达、培养条件后，ＩＧＦ－Ⅱ在高密度发酵上清中的产量可达６０ ｍ ｇ／Ｌ．对Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ产生的ｒｈＩＧＦ－Ⅱ的性质分析表明，其具有正确的分子量，Ｎ 端和较好的生物活性．

外源基因在甲醇营养型酵母中的表达及优化表达策略

甲醇营养型酵母作为第二代酵母近年来在基因工程产品制备过程中得以广泛应用 ,目前已成为独具特色的外源基因表达系统。外源基因在表达过程中受多种因素影响。本文就外源基因在甲醇营养型酵母中的表达。

甲醇营养型酵母高密度培养过程中甲醇和乙醇的GC快速检测

采用气相色谱法 (GC)快速检测甲醇营养型酵母发酵液中的甲醇、乙醇含量 ,具有样品处理简便 ,测定时间较短 ,结果重现性好的特点。在 1～ 10mg/mL范围内具有很好的线性关系。在毕赤酵母高密度高表达发酵过程中应用此法对甲醇和乙醇进行实时监控 ,细胞终密度超过 30 0g/L(干重 )。本方法为甲醇营养型酵母工程菌的发酵中试工艺研究提供了重要的发酵生化参数。

甲醇酵母表达系统

近年来，甲醇酵母作为一种新的蛋白表达系统，已得到越来越广泛的应用。本文对这一系统作一简要概述，主要描述了甲醇酵母的优点，甲醇酵母的生物学及其转化等方面。

甲醇酵母基因表达系统的研究进展

在大肠杆菌这一传统表达系统被频繁用作研究各种基因表达时，一种新型且有效的基因表达系统——甲醇酵母正逐渐引起人们的注意。此系统不仅具有高表达、高稳定、高分泌的特点，而且其宿主甲醇酵母——巴斯德毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）具有高密度生长的特性。因此近年来此表达系统的研究得到迅速发展，在其中表达了多种具有商业价值的外源蛋白。本文对甲醇酵母基因表达系统的特点及研究进展作一简要综述。

甲醇酵母基因表达系统研究

甲醇酵母基因表达系统是近年来发展起来的一种较为成熟的基因表达系统 ,它具有表达量高、产物活性保持好、产物易于分离纯化、发酵工艺成熟、成本低廉等许多优点。介绍了该系统的受体菌、表达载体、转化以及影响表达的主要因素等方面的内容。

甲醇酵母表达系统研究进展

甲醇酵母是一种新的基因表达系统 ,有着许多突出的优点。多种重组蛋白已在甲醇酵母获得成功表达。

胰岛素原基因的高效分泌表达系统——甲醇酵母Pichia pastoris

为了提高重组人胰岛素的表达效率,使用了近年发展起来的真核表达系统-甲醇酵母Pichia pastoris. Pichia pastoris以甲醇为其惟一碳源,而乙醇氧化酶基因的启动子是强启动子,可用来调控异源蛋白的表达.该系统具有操作技术简单,可进行高水平的胞内或胞外表达,及对表达产物进行翻译后修饰与加工等显著优点.将含有小C肽或不含有C肽的人胰岛素原类似物基因整合到酵母基因组上来发酵生产人胰岛素原,在表达量上,每升发酵液中可以得到胰岛素原250～300mg,分泌水平约占总蛋白量的20%,重组人胰岛素具有与猪胰岛素相同的受体结合能力和生物活性.

多形汉逊酵母外源基因表达系统

多形汉逊酵母是一种有很大潜力的外源基因表达系统 ,已在科研和工业化生产上广泛应用。用它生产来源于真核生物的外源基因有许多优点 ,如重组菌减数分裂稳定、能进行正确的翻译后加工和修饰、表达量高等。许多有商业价值的蛋白质在这一系统中得到成功表达 ,有的已投入市场。本文综述多形汉逊酵母宿主菌的生物学特性、基因工程操作技术。

毕赤酵母外源基因表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间型和胞内型蛋白质。与酿酒酵母Saccharomycesceresiviae相比 ,该系统所具有的很多优势使其应用越来越广泛。有关研究主要涉及以下几个方面 :宿主菌株、表达载体、转化方法、外源基因整合、外源蛋白糖基化和高密度发酵培养等。

酵母作为外源基因表达系统的研究进展

甲醇营养型酵母和裂殖酵母作为外源基因表达的有效系统 ,正引起人们广泛研究。甲醇营养型酵母具有易诱导调控、适用于高密生长、能高效表达外源蛋白的特点。裂殖酵母有许多与高等真核细胞相似的特点 ,是研究真核分子生物学和真核基因表达有用的工具。本文综述了这两个酵母表达系统的特点。

毕赤酵母表达系统研究进展

毕赤酵母是外源蛋白表达的一种重要宿主。毕赤酵母表达系统既具有原核表达系统操作简单、价格低廉、生产率高的优点,又具有真核表达系统能对表达后的蛋白折叠、糖基化和形成二硫键等翻译后进行加工和修饰的功能,因此毕赤酵母表达系统具有广泛的应用前景和重要的研究价值。本研究对毕赤酵母表达系统的特点、组成、影响外源基因高效表达的影响因素等进行总结。

人胰岛素原在甲醇酵母(Pichia pastoris)中的高效表达

甲醇营养型酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ在近十几年已被人们广泛用作外源基因表达的系统。表达的是可溶性蛋白，且胞外分泌。本研究系将外源基因（胰岛素原基因）连接到穿梭质粒ＰＨＩＬ－Ｓ１上，再通过同源重组到酵母染色体，筛选表达株。用１ 升发酵罐在甲醇诱导下可获得０．

人TRAIL在毕氏酵母表达系统中的表达

目的 在甲醇营养型酵母（Ｐｉｃｈｉａ）中，表达人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（ＴＲＡＩＬ）分子。方法 将可溶性ＴＲＡＩＬ基因片段插入酵母表达载体ｐＩＣ３．５，经氯化锂转化酵母ＧＳ１１５，甲醇诱导表达，５ｄ后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ进行分析，并用Ｌ９２９细胞测定其活性。结果 在酵母细胞中表达的ＴＲＡＩＬ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析占总蛋白的５０％以上。

抗Aβ人源融合抗体在毕赤酵母中的高效表达纯化及性质研究

抗β-淀粉样多肽(Aβ)的抗体对老年性痴呆(AD)病变有清除作用,人源融合抗体由可识别结合Aβ的多肽序列A与人抗体Fc段连接重组构成。构建的单拷贝表达载体PA0815-αAFc,可以在毕赤酵母中高效表达。此表达载体含有一个AFc表达单元,并在受严格调控的醇氧化酶启动子的控制下由甲醇诱导表达,并利用α因子前导肽引导融合抗体分泌。载体线性化后整合入甲醇营养型酵母Pichia pastoris(Pp)GS115基因组中,经鉴定表达单位具有良好的遗传稳定性。对筛选得到的高分泌表达融合抗体的细胞株进行表达和培养条件的优化,使诱导上清液中融合抗体的产量选到100mg/L。利用Protein A层析柱分离、纯化,获得纯度较高的融合抗体。经鉴定分析其具有正确的分子量和N末端,且融合抗体可与Aβ抗原结合并能吸引巨噬细胞吞噬和清除抗原抗体复合物,具有抗体生物学活性。这是首次利用甲醇营养型酵母表达系统成功实现了抗Aβ融合抗体的高效分泌表达及产物纯化鉴定,为进一步研究AD及其治疗提供了新的途径。