插入缺失位点和miniSTR在甲醛固定石蜡包埋组织中的应用检测

目的:研究插入缺失位点InDel与mini短串联重复序列(STR)遗传标记对甲醛固定石蜡包埋组织应用的价值。方法:19份甲醛固定石蜡包埋组织作为疑难检材,应用3种常染色体遗传标记多重扩增系统,即InDel系统(Investigatior■DIPplex Kit)、miniSTR系统(华夏白金扩增试剂盒)和STR系统(Goldeneye®20A),对STR分型不完整或失败的检材,再分别用InDel和miniSTR系统进行DNA分型检测,比较两者的分型质量和检出率。结果:19份甲醛固定石蜡包埋组织经Goldeneye 20A试剂盒检测,均分型不完整。应用miniSTR系统检测显示,7份样本的检出率100%,其中,D19S433基因座的检出率为100%,D5S818、D13S817和D1S1656基因座的检出率最小,为36.84%。应用InDel系统检测发现,1份样本InDel位点电泳分型完整,所有样本的位点丢失率均小于50%,其中7份样本的位点丢失率低至10%以下。结论:应用遗传标记对甲醛固定石蜡包埋组织这类疑难降解检材进行检测,插入缺失多态性位点InDel与miniSTR可以作为联合检测标记。

甲醛固定石蜡包埋组织4种DNA提取方法的比较分析

本研究以10例甲醛固定石蜡包埋组织(FFPET)作为疑难检材,将其制成蜡膜,分别以二甲苯-Chelex100法、脱蜡液-Chelex100法、脱蜡液-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation试剂盒(简称FP试剂盒)、脱蜡液-北京天根石蜡包埋组织基因组提取试剂盒法(简称天根试剂盒)提取DNA,进行紫外分光光度计测定(浓度、纯度)及短串联重复序列(STR)分型检测(23个常染色体),通过比较分析FFPET在4种不同提取方法中的提取质量、STR分型质量和检出率,从而寻求一种高效简便、经济实用、方便快捷的甲醛固定石蜡包埋组织中DNA提取方法。结果表明:应用4种方法提取的石蜡包埋组织蜡膜DNA经紫外分光光度计测定后显示,应用2种Chelex100法提取的DNA浓度高于2款试剂盒,试剂盒提取的DNA的纯度优于另外2种方法,以上差异均具有统计学意义(P<0.05);FP试剂盒提取DNA的平均浓度和纯度均优于天根试剂盒,无显著性差异(P>0.05);STR分型普遍存在不同基因座和同一基因座不同等位基因之间的扩增不均衡,呈现前高后低状态;STR平均检出率为FP试剂盒>天根试剂盒>Chelex100法,2种Chelex100法STR基因座检出率比较无显著差异(P>0.05),但分别和另外2种方法试剂盒方法相比有显著差异(P<0.05),FP试剂盒和天根试剂盒法相比有显著差异(P<0.05)。因此,在涉及甲醛固定石蜡包埋组织这类疑难检材的法医DNA鉴定案件时,脱蜡液-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation试剂盒法优于其余3种提取DNA方法。

非小细胞肺癌甲醛固定石蜡包埋切片DNA再利用的可行性研究

目的对非小细胞肺癌(NSCLC)甲醛固定石蜡包埋(FFPE)标本经免疫组化染色后的DNA质量进行评估,旨在探讨针对标本量较少或难以获取的标本利用免疫组化染色后进行DNA提取及相关分子检测的可行性。方法随机选取2017年6月至2017年12月东部战区总医院病理科NSCLC FFPE标本50份,每份标本分别切片12张。随机选取其中6张切片作为对照组,直接进行DNA提取;其余6张切片作为实验组进行免疫组化Envision二步法染色后进行DNA提取。对所有提取DNA进行表皮生长因子受体(EGFR)、鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)以及鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1(BRAF)基因突变检测。结果 50份NSCLC FFPE标本实验组提取DNA浓度及纯度与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。50份实验组NSCLC FFPE标本中,EGFR基因突变率为40%(20/50)、KRAS基因突变率为16%(8/50)、BRAF基因突变率为10%(5/50);50份对照组NSCLC FFPE标本中,33份分别检测出相应的EGFR、KRAS、BRAF基因突变,17份检测出阴性结果。实验组和对照组检测结果符合率达100%。结论 NSCLC FFPE标本,尤其是标本量较少或难以获取的样本,经免疫组化染色后能够提取高质量的DNA,且可用于靶基因的下游分子分析,为稀缺或难以获取的临床样本后续分子检测提供一种解决办法。

优化甲醛固定石蜡包埋组织DNA提取预处理对STR分型有效性的研究

目的通过对甲醛固定石蜡包埋组织（FFPET）DNA提取进行优化处理,确定满足FFPET样本进行短片段重复序列（STR）完整分型的条件。方法改变石蜡切片厚度、离心速率和时间、组织用量和消化液体积等参数提取FFPETDNA,并对提取的DNA样本进行常规STR扩增检验。结果优化方法处理后可以提取到较高质量DNA（1000bp）,经扩增均可以检出性别基因座（amelogenin）和15个以上STR基因座。结论 FFPET优化方法能够提高DNA提取的质量,适合STR分型研究。

PCR-RFLP技术在甲醛固定石蜡包埋组织中的应用

目的:探讨mtDNA分析技术在甲醛固定石蜡包埋组织中的应用。方法:应用限制酶RsaI和MnlI消化mtDNA D-LOOP区(HVI16106-16297)PCR扩增产物,聚丙烯凝胶电泳进行RFLP分型的方法,对随机个体血液样品150例,正常组织10例和甲醛固定石蜡包埋组织5例进行检验。结果:在150例随机个体中,RsaI和MnlI酶切分别发现3和8种表型。在10例正常组织中,各个组织的带型完全相同。5例包埋组织的RFLP分型与对照组织一致。结论:PCR-RFLP技术适合于甲醛固定石蜡包埋组织的检验。

靶向新一代测序技术在甲醛固定石蜡包埋结直肠癌组织RAS突变检测中的应用与验证：对比Sanger测序与ARMS实时PCR技术

目的通过与Sanger测序与扩增阻滞突变系统（ARMS）技术对比，验证靶向新一代测序平台Ion TorrentPGM在甲醛固定石蜡包埋（FFPE）结直肠癌组织标本KRAS2号外显子及扩展RAS突变检测中的应用。研究地点中国北京。研究对象随机选取51例中国北京协和医院病理科存档的FFPE结直肠癌标本（36例男性，15例女性）。在检测前，这些标本的病理诊断及肿瘤组织含量均经资深病理医师确认。方法分别利用PGM平台、Sanger测序技术以及Therascreen KRAS突变检测试剂盒检测51例FFPE结直肠癌标本中RAS突变情况，评估3种方法之间的一致性，进而通过检测梯度稀释的FFPE细胞系（突变状态已知）来探讨PGM平台的检测敏感性。结果应用PGM平台，51例标本中13例（25．5％）检出了KRAS2号外显子突变。针对KRAS2号外显子突变检测，PGM平台与Sanger测序之间的一致性达100％（51／511[κ=1．000，95％可信区间（C／）：1～1]；PGM平台与Therascreen检测试剂盒之间的一致性为98．04％（50／51）（κ=0．947，95％CI：0．844～1），仅有1例不一致的病例，其KRAS2号外显子突变为c．37G〉T突变，该突变未被Therascreen检测试剂盒覆盖。梯度稀释实验结果显示，PGM平台能够检出突变频率低至1％的KRAS突变。重要的是，在51例标本中，PGM平台还检出了10例KRAS2号外显子以外区域的RAS突变。此外，PGM平台还能够同时检出RAS以外的其他结直肠癌相关基因的突变。结论靶向新一代测序平台兼具特异性与敏感性，适合应用于KRAS2号外显子突变的临床常规检测。此外，该平台节省样本与时间、性价比高，在FFPE结直肠癌标本的扩展RAS突变检测以及其他结直肠癌相关基因突变检测方面具有重要的临床应用前景。

组织固定对下游基因和蛋白分子检测的影响

甲醛固定石蜡包埋(formalin fixed and paraffin embedded,FFPE)组织是检测特异性生物标志物的主要标本来源之一。若未进行标准化的固定,用甲醛固定的组织作为下游检测的标本出现的问题较多,如会发生DNA碱基与附近组蛋白的交联、会引起组织中的DNA片段化等等。为全面了解FFPE标本对下游检测的影响,该文从其对蛋白质、DNA、RNA和miRNA等检测的影响作一综述,使病理工作者在今后的工作中,做好FFPE标本的固定处理,为下游的检测打好基础,让整个固定过程更加标准化,实现病理组织标本的精准固定。

组织芯片和基因突变检测在肺癌及乳腺癌石蜡组织中的应用

目的:探讨利用石蜡包埋的人类肿瘤组织开展病理新技术临床应用的可能性和可行性。方法:存档肺癌、乳腺癌的石蜡组织,分别进行组织芯片的制备和基因突变的检测。结果:组织芯片用于常规切片染色和免疫组化等分子病理学研究;存档石蜡组织切片可用于基因突变检测。肺癌FFPE中的DNA经PCR扩增后,核酸电泳显示结果良好。结论:运用分子病理学技术和病理科存档蜡块,可以广泛应用于大宗病例的回顾性研究,为人类肿瘤研究提供良好的基础,也可以为临床肿瘤诊疗提供分子病理学依据。

PCR-SSCP技术分析线粒体DNA多态性及其法医学应用

目的探讨SSCP法在线粒体DNA分析中的应用及其在法医实际检案中的意义。方法利用PCR方法直接扩增D-LOOP区的HVI16106-16297区域192bp片段作为目的片段,进行SSCP分型。检验150例随机个体、10例正常组织和5例甲醛固定石蜡包埋的组织。结果在150例随机个体中,SSCP检测发现9种单倍型,DP值为0.881。在10例正常组织中,各个组织的SSCP带型完全相同。5例包埋组织的SSCP分型与对照组织一致。结论 SSCP技术分析线粒体DNA有较高的鉴别能力,适用于陈旧降解检材的检验。

Hsa-miR-181a在子宫内膜癌变过程中的表达及意义

目的:探讨hsa-miR-181a(miR-181a)在子宫内膜癌变过程中的表达及其意义。方法:选取甲醛固定石蜡包埋组织75例,其中正常子宫内膜13例,子宫内膜增生症18例,子宫内膜癌44例。提取总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测各组子宫内膜组织中miR-181a的表达量。结果:在甲醛固定石蜡包埋组织中可检测到miR-181a的表达。miR-181a在子宫内膜癌组织中的表达高于子宫内膜增生症,在子宫内膜增生症组织中的表达高于正常子宫内膜,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-181a的表达与FIGO分期有关,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-181a在子宫内膜癌组织中表达上调,可能起到了癌基因的作用;miR-181a在子宫内膜癌变过程中的差异表达可能与子宫内膜癌的发生、发展有关。

高通量测序分析miRNAs在胃癌新鲜组织与石蜡包埋组织中的表达

目的利用二代测序技术对FFPE标本进行高通量测序及相关的生物信息学分析,探讨miRNAs在来源于石蜡包埋胃癌组织(FFPE)中的标本检测的可靠性,探讨其临床意义。方法选取2015年和2016年2例胃癌患者手术切除同一组织的FFPE和新鲜冰冻标本,从标本中提取RNA并分离构建small RNA文库,采用Illumina测序平台测序的方法对其进行高通量测序,统计各已知miRNAs家族序列的表达量,构建已知miRNAs表达谱,对标本miRNAs进行Spearman相关性分析,评估miRNAs表达量的差异变化情况。结果新鲜冰冻标本中提取的总RNA质量较高,RNA保存度完整,显示28S是18S的1.3~1.4倍,从石蜡组中提取的RNA,结果显示有不同程度的降解,28S和18S的波峰不明显,miRNAs表达谱在冰冻和FFPE标本中,Spearman相关系数分别为0.90和0.86,两者miRNAs表达量较一致,具有相关性。结论 FFPE中的miRNAs仍然保持一定的完整性,且可通过二代测序进行肿瘤标本检测。

基于串联杂合泛素结合结构域探针的多聚泛素化信号免疫组织化学检测技术研究

目的提高串联杂合泛素结合结构域(ThUBD)探针检测甲醛固定石蜡包埋(FFPE)切片中多聚泛素化信号的灵敏度。方法利用微波炉加热方法,采用不同盐离子种类和pH缓冲液进行抗原修复,在有无高浓度还原剂条件下,用ThUBD探针检测FFPE切片中的多聚泛素化信号。结果在pH 9.5 EDTA缓冲液条件下,加入50 mmol/L DTT可检测到FFPE切片中明显的多聚泛素化信号。结论pH 9.5 EDTA缓冲液中加50 mmol/L DTT有利于多聚泛素链的暴露与复原,显著提升ThUBD探针用于免疫组织化学检测的灵敏度。

激光显微切割/质谱联用技术在肾脏疾病诊断中的应用进展

激光显微切割(Laser microdissection,LMD)质谱(Mass spectrometry,MS)联用技术(LMD/MS)已成功应用于肾活检组织甲醛固定石蜡包埋切片的蛋白质组学研究,提高了某些肾脏病的诊断水平,显示出较好的临床应用前景。文中就LMD/MS蛋白质组学技术的原理、方法及该技术在肾淀粉样变性、膜增殖性肾小球肾炎等肾脏疾病的发病机制及诊断分型的应用进展进行综述。

间叶性软骨肉瘤HEY1-NCOA2融合基因的检测分析

目的探讨在间叶性软骨肉瘤的甲醛固定石蜡包埋组织中检测HEY1-NCOA2融合基因对间叶性软骨肉瘤的诊断价值。方法收集间叶性软骨肉瘤6例,尤文肉瘤、滑膜肉瘤、孤立性纤维性肿瘤/血管外皮瘤各5例作为对照,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组病例中有无HEY1-NCOA2融合基因并以PGK基因为内参检测RNA的质量。结果6例中有4例成功提取到总RNA,其中3例检测出HEY1-NCOA2融合基因,阳性比例为3/4,对照组均未检测出HEY1-NCOA2融合基因。结论HEY1-NCOA2融合基因在间叶性软骨肉瘤中有较高的检出比例。