2007-2009年广西壮族自治区甲3亚型流感病毒HA1基因变异的特征研究

目的从HA1基因层面探讨2007-2009年广西壮族自治区(广西)甲3流感病毒的变异、进化发展规律,探寻与WHO疫苗推荐株以及上海市、北京市和浙江省等地当年流行株之间的差异。方法提取广西22株2007-2009年甲3流感毒株RNA,并测定其血凝素重链(HA1)区域的核苷酸序列,采用生物信息软件,分析与当年疫苗推荐株及上海、北京和浙江等地在HAI以及HAI抗原决定簇区域的差异,分析进化关系。结果 22株广西甲3流感病毒2007年与2008年比较接近,HA1区核苷酸和氨基酸的同源性均值分别为99.39%和99.08%;而与2009年变异较大,同源性均值分别为99.04%和97.78%。而对比世界卫生组织(WHO)推荐的2008-2009年甲3流感疫苗株A/B risbane/10/2007,广西3年分离株HA1区氨基酸酸同源性均值分别为99.81%、99.25%和97.94%。2009年广西甲3流感病毒与当年疫苗株比较,HA1抗原决定簇发生了6个氨基酸的替换,且发生在A、D、E三区。各年度散发株和暴发株同源性较均在99.00%以上。2007年广西甲3毒株与上海及北京比,HA1区氨基酸同源性均值分别为99.83%和99.12%,2008年比较结果分别为98.93%和99.25%。基因进化树分析显示2009年分离株与2007年、2008年及当年疫苗株距离较远,单独分支。结论广西2007年与2008年甲3流感病毒HA1基因特性较为接近,2009年毒株发生了较大变异。广西与上海、浙江等地分离株更为接近,而与北京分离株差异较大。WHO推荐的当年疫苗株均滞后广西流行株。

2015年盐城市甲型H3N2亚型流感病毒HA1基因分子进化特征分析

目的了解盐城市2015年甲型H3N2流感病毒分离株表面血凝素HA1基因分子进化特征。方法对哨点医院流感样病例标本进行核酸检测、病毒分离;选取甲型H3N2毒株,采用一步法RT-PCR扩增其HA1区,并进行序列分析,采用DNAStar软件包中MegAlign进行核苷酸及氨基酸同源性分析,以MEGA6.0软件进行序列比对及基因种系进化特征分析。结果 2015年盐城市流感样病例(ILI)监测样本中流感病毒核酸阳性率为8.36%,乙型、甲型H3N2、新甲H1N1型交替流行。抽取的7株甲型H3N2分离株,其HA1基因核苷酸同源性为98.7%~100.0%,氨基酸同源性为97.9%~100.0%;其HA1区氨基酸位点变异呈散在性分布,均未发生氨基酸的丢失和插入,氨基酸突变主要位于抗原决定簇的A、B和C区。除A/JSYC/11025/2015外,其余6株新增2个糖基化位点,其中158aa位点位于抗原决定簇B区。结论 2015年盐城市流感流行以甲型H3N2和乙型Yamagata系为主,具有典型的冬、夏双高峰特点。病毒HA1区基因特性逐渐发生变异,可能导致抗原变化,应进一步加强流感病原学监测。

2022—2023年北京市通州区甲型H3N2亚型流感病毒血凝素基因特征分析

目的分析2022—2023年北京市通州区流感病原学监测中甲型H3N2亚型流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因特性,为流感防控提供科学依据。方法对通州区2022—2023年流感病原学监测结果进行统计分析,选取不同时间分离到的34株甲型H3N2亚型流感毒株,进行HA基因扩增和测序,应用MEGA11进行HA基因的核苷酸和氨基酸变异分析,采用邻接法构建HA基因遗传进化树,在线预测N-糖基化位点,分析其基因变异和进化特征。结果2022—2023年共检测流感病原学监测样本3660件,流感病毒核酸阳性率为21.50%,其中甲型H3N2亚型流感病毒占比为57.81%。发热疫情样本共计4855件,流感病毒核酸阳性率为54.25%,其中甲型H3N2亚型流感病毒占比为61.50%。34株甲型H3N2亚型流感病毒的HA基因序列与疫苗株A/Darwin/9/2021相比,核苷酸相似度为97.00%~98.50%,氨基酸相似度为97.40%~98.10%。基因进化分析显示,2022—2023均分布在3c.2a1b.2a分支,2022年8—11月分离的14株毒株分布在1a.1亚分支,2023年2—3月分离的20株毒株则分布在2a.3a.1亚分支。与疫苗株相比,2022—2023年的34株毒株在4个抗原决定簇上(B、C、D和E)发生了多位点氨基酸变异,且在186和225位点上均发生了替换。2022年的14株毒株,增加了158NYTY位点,存在13个潜在糖基化位点,2023年的20株分离株122NESF糖基化位点丢失,共有12个潜在糖基化位点存在。结论2022—2023年,北京市通州区人群中流行的甲型H3N2亚型流感病毒分布在2个进化分支上,2023年3C.2a1b.2a.2a.3a.1分支取代了2022年3C.2a1b.2a.1a.1分支,成为流行株。及时分析流感病毒基因特性和进化趋势,对流感的防控有重要意义。

贵州省3株甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列分析

目的对贵州省3株甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列进行分析。方法提取核酸,PCR扩增,测序分析、比对。结果同源性分析和系统发育树都说明了相同(或相近)年份的毒株核苷酸序列同源性较高,亲缘关系较近;不同年份的毒株核苷酸序列的同源性较低,亲缘关系较远;3株H3N2毒株共有59各位点核苷酸替换。结论通过序列测定分析,结果表明1995-2005年纵向比较,贵州省甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列发生了变异;通过与Genbank上相应年份标准株横向比较,贵州省3株甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列未发生大的变异,仅有少数核苷酸的替换。

2016-2017年我国甲型流感病毒H3N2亚型HA和NA基因的分子特征分析

目的探讨2016-2017年我国甲型流感病毒H3N2亚型血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因的分子特征,为甲型流感病毒H3N2亚型的防控提供科学依据。方法从全球共享禽流感数据库(GISAID)中获得我国2016~2017年分离的525株甲型流感病毒H3N2亚型病毒和13株H3N2亚型参考株的HA和NA基因序列。应用MEGA 6.0软件分析HA和NA的分子进化特征、氨基酸位点和耐药位点的变异情况。结果进化树分析显示13株参考株之间HA和NA氨基酸的同源性均为96.9%~99.1%。2016-2017年我国甲型流感病毒H3N2亚型的病毒株HA和NA氨基酸序列之间同源性均为96.3%~100%,HA和NA的优势亚分支均为3C.2a.1,相当一部分毒株分型不够明确。HA氨基酸变异分析显示9株发生N121E突变,103株发生N121K的突变且主要来源于2017年的香港毒株;182株发生G/R142K突变;A/Hong_Kong/3079/2017-HA和A/Guangdong-Chengguan/1383/2017-HA均发生A128I突变;NA蛋白仅3株(A/Hunan-Suxian/1980/2016-NA、A/Hunan-Yuhua/11799/2016-NA和A/Ningxia-Yuanzhou/1657/2016-NA)发现H275Y耐药位点突变。结论 2016-2017年我国甲型流感病毒H3N2亚型的HA和NA蛋白与参考株间存在一定的差异,优势亚型均为3C.2a.1;与病毒的毒力及药物相关的部分关键氨基酸位点发生变异。应密切关注H3N2病毒的分子特征,为其防控提供参考。

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

江西省2005～2006年甲1亚型流感病毒株与疫苗株的HA1区差异分析

[目的]分析江西省2005～2006年分离的甲1亚型流感病毒株与疫苗推荐株HA1区的差异,以了解江西省流感病毒变异情况及WHO推荐疫苗株对人体的保护作用。[方法]采集监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分离,对分离到的甲1亚型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒基因后进行核苷酸序列测定,用DNAStar5.0、BioEdit(Version5.0)、Mage生物软件对测序结果进行分析处理,并与WHO推荐疫苗株进行比对。[结果]20株甲1亚型流感病毒HA1区域核苷酸序列长度均为960bp,未发现核苷酸的丢失和插入,平均点突变率为2.94%。2005年甲1亚型流感病毒分离株与2005年WHO北半球流感甲1亚型疫苗推荐株A/New caledonia/20/99(H1N1)HA1区相比较,不同毒株氨基酸的同源性是96.9%～98.1%,替换数在6～10个之间,涉及2～3个抗原决定簇,抗原决定簇区的氨基酸变异数平均为2.33。2006年甲1亚型流感病毒分离株与疫苗推荐株HA1区相比较,不同毒株氨基酸的同源性是95.3%～97.2%,、替换数在9～15个之间,涉及4个抗原决定簇,抗原决定簇区的氨基酸变异数平均为6.0个。2006年我省甲1亚型流感病毒分离株与WHO疫苗推荐株之间在HA1区域的氨基酸差异以及抗原决定簇上氨基酸的差异,均显著大于2005年我省甲1亚型流感病毒分离株与WHO疫苗推荐株之间差异(P﹤0.0005)。[结论]2005年根据WHO疫苗推荐株生产的疫苗对该年度我省的甲1亚型流感总体上有较好的预防效果,而2006年根据WHO疫苗推荐株生产的疫苗对我省该年度的甲1亚型流感预防效果不够理想。

杭州市2013～2014年流感暴发流行期甲型流感病毒H3N2亚型基因特性分析

目的分析杭州2013~2014年冬春季流感暴发期间流行的甲型流感病毒H3N2亚型的分子特性。方法选取H3N2阳性标本提取病毒RNA,PCR扩增全基因组并测序,构建血凝素（HA）及神经氨酸酶（NA）分子进化树,对H3N2亚型的病毒进化进行分析。结果 6个代表株中H3N2未发生片段间的重配。以WHO推荐流感疫苗株A/TEXAS/50/2012为参考,HA1蛋白主要抗原决定区发生N145S氨基酸替换,并有其他多个位点的突变。病毒基质蛋白（M2）的金刚烷胺耐药位点全为S31N,神经氨酸酶抑制剂耐药位点未发生突变。结论 H3N2亚型甲型流感病毒HA1蛋白的氨基酸变异与2013~2014年杭州地区暴发流行有关。另外,病毒已出现对金刚烷胺的耐药突变,而对神经氨酸酶未发生耐药突变。

H3N8亚型马流感病毒HA1基因原核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法从马流感病毒中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)中扩增的HA1基因片段,将其克隆到表达载体pET-28a(+)中,测序正确后转化入Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌表达出约53ku,以沉淀性形式存在的重组蛋白,且在37℃,0.4mmol/L IPTG条件下诱导8h表达效果最好。表达产物经切胶纯化后得到纯度较高的目的蛋白。经Western-blot分析,表达的蛋白与抗马流感病毒阳性血清发生特异性反应,证实该蛋白具有良好的反应原性。

辽宁省甲1亚型流感病毒HA1基因变异分析

目的了解2000～2006年辽宁省甲1亚型流感病毒HA1基因变异特征。方法利用辽宁省流感监测的咽拭分离株中的甲1亚型流感病毒核酸，采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增，测序，并推导出其氨基酸序列，进行基因进化特征分析。结果辽宁省2000～2002年均分离到甲1亚型流感病毒，但消失了近3年后，2005年底又出现，且基因序列碱基发生变异，与2005年以前的病毒株和疫苗株A／New Caledonia／20／1999比较，在其HA1蛋白分子上存在有4个氨基酸位点（187位W〉R，188位Y〉F，209位Q〉K，249位V〉A）发生了替换。基因序列及氨基酸序列同源性均有下降。结论辽宁省2000～2006年甲1亚型流感病毒基因序列发生了明显变异，与甲1亚型疫苗株A／New Caledonia／20／1999同源性有下降趋势，提示其抗原可能发生部分漂移或更换，这对流行季节疫苗选择和流行病学研究都具有重要意义。

2007年江西省甲3亚型流感毒株HA1基因特性的分析

目的了解江西省2007年分离的甲3亚型流感病毒株HA1基因变异特征,分析WHO2007～2008年甲3亚型疫苗推荐株对江西省甲3亚型流感的预防效果。方法采集监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分离,对分离到的H3型流感病毒进行核酸提取,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒HA1基因后进行核苷酸序列测定,用DNAStar5.0、BioEdit(Version5.0)、Mage生物软件对测序结果进行分析处理,推导出氨基酸序列,进行基因特性分析。结果所选取的8株甲3亚型流感病毒HA1区域核苷酸序列长度均为960bp,未发现核苷酸的丢失和插入,平均点突变率为1.13%。2007年甲3亚型流感病毒分离株与2007～2008年WHO疫苗推荐株HA1区相比较,不同毒株氨基酸的同源性是97.8%～98.4%,在2个抗原决定簇区的氨基酸变异数平均为3.25个,但有毒株已出现在2个抗原决定簇区4个氨基酸替换。结论2007年根据WHO2007～2008年推荐疫苗株生产的疫苗对我省的甲3亚型流感预防效果不够理想。

天津地区2005年甲1亚型流感病毒HA1区基因特性分析

目的了解天津地区夏季一起小学校流感样暴发疫情中分离出2株甲1亚型流感病毒株HA1基因变异情况。方法MDCK细胞和鸡胚双腔法分离流感病毒,收获病毒液提取病毒的RNA,进行RT-PCR,扩增产物纯化后测序,用DNASTAR软件进行序列分析。结果新分离株HA1基因长度为325个氨基酸,与国际疫苗株A/NewCaledonia/20/99相比氨基酸同源性高于98%,氨基酸替换位点有5个,其中165位位于抗原决定簇Ca1区。结论天津地区新分离甲1亚型流感病毒抗原性发生进一步漂移,但变异程度不大。

吉林省2018-2020年甲型H3N2亚型流感病毒耐药基因分析

目的掌握2018-2020年吉林省内H3N2亚型流感流行株对金刚烷胺类药物以及神经氨酸酶抑制剂类药物的耐药情况,为流感的临床治疗及预防控制提供参考依据。方法选取甲型H3N2亚型流感毒株34株,对M2和NA基因进行PCR扩增,测序后对耐药位点进行分析。结果2018-2020年吉林省分离到流感毒株981株,其中甲型流感病毒毒株934株,乙型流感毒株47株。在分离到的甲型流感病毒毒株中,57.49%为H1N1pdm亚型毒株,39.61%为H3N2亚型毒株。对34株H3N2亚型流感病毒测序结果显示M2基因S31N耐药位点上发生了突变;在NA耐药相关基因位点E119V、Q136K、D151A、I222V、H274Y、R292K、N294S均未发生突变。结论吉林省2018-2020年以甲型流感流行为主。34株甲型H3N2亚型流感病毒均对金刚烷胺类药物耐药,但仍对神经氨酸酶抑制剂敏感。

1998～1999年浙江省甲3型流感病毒代表株HA_1序列比较

目的 对浙江省 1998年初至 1999年底流行的甲3 型流感病毒的不同血凝特性进行分析。方法 采用对甲3 流感病毒的血凝素基因HA1 进行核苷酸序列测定。结果 占我省分离株主流的对鸡红细胞不凝集的O相代表株A/浙江 6 /99其HA1 区域与当年的国际标准株A/武汉 /35 9/95血清学交叉HI试验抗原比为2 2 6 ,两者的氨基酸同源性仅为 94 82 % ,存在较大差异 ,而在分离中占极少数的对鸡红细胞凝集的D相代表株A/浙江 /10 /98与A/武汉 /35 9/95的血清学交叉HI试验抗原比为 0 7,两者的同源性为 99 7% ,几乎无差异。结论 近年我省甲3 型流感流行的主要原因 ,是由于流感病毒在免疫压力下在HA1

2013~2014年上饶市甲1亚型流感病毒HA1基因特性的分析

目的 了解上饶市2013~2014年分离到的甲1亚型流感病毒HA1基因变异特性和规律,分析WHO甲1亚型疫苗推荐株对上饶市甲1亚型流感的预防效果。方法 采集流感病例咽拭子标本进行病毒分离,对分离到的甲1流感病毒采用RT-PCR方法 扩增病毒基因,进行核苷酸序列测定,使用DNAStar、Mage软件对测序结果 进行分析和处理,且与WHO 2013~2014年推荐的疫苗株进行比对。结果 2013~2014年10株甲1亚型流感病毒HA1没有发现核苷酸丢失和插入,上饶市流感病毒分离株与WHO疫苗推荐株之间差异很小,只有A/JiangxiXinzhou/SWL116/2014株有2个变异位点位于抗原决定簇A区和抗原决定簇B区内。结论 2013~2014年WHO疫苗推荐株生产的疫苗对我市这两年甲1亚型流感具有一定的预防效果,可推广使用。

2014-2016年镇江市甲型H3N2流感病毒HA和NA基因遗传进化研究

目的对2014-2016年镇江市甲型H3N2流感病毒的HA和NA基因进行分子流行病学分析,了解其进化特征。方法收集2014-2016年镇江市流感样病例咽拭子标本,对核酸检测鉴定为阳性的标本进行病毒分离;随机抽取13株经血凝抑制试验(HI)鉴定确认为甲型H3N2亚型毒株,用特异性的引物扩增其HA和NA基因,进行序列分析。对分离株和疫苗株、参比毒株的核苷酸、氨基酸同源性进行分析,对其抗原表位、耐药位点和糖基化位点进行分析。结果 2014-2016年镇江市共采集9 532份流感样标本,流感病毒阳性检出率为11.77%,3年分别为11.23%、13.82%和10.61%,差异有统计学意义(χ^(2)=16.602,P<0.001)。甲型H3N2亚型为最主要的亚型(占43.76%),其次为乙型BY型(占35.65%);除2015年乙型BY亚型为主(占70.13%),2014年、2016年均以甲型H3N2亚型为主(分别占48.30%、54.80%)。与北半球疫苗株A/Texas/50/2012(2013-2015)及A/Switzerland/9715293/2013(2015-2016)比对,选取的13株甲型H3N2镇江分离株的HA和NA基因核苷酸、氨基酸的同源性均≥97.4%,与北半球疫苗株HA和NA基因核苷酸、氨基酸的同源性均≥94.8%。13株镇江分离H3N2毒株主要分为4个进化分支。13株均未出现主要抗原位点氨基酸序列缺失,存在Y94H、A128T、S138A、G142R等散点性突变。与M2、NA蛋白相关的耐药位点未发现变异;3株糖基化位点发生D329N氨基酸替换。结论甲型H3N2亚型流感病毒是镇江市优势流行亚型。主要抗原位点、耐药位点均未发现重要突变,糖基化位点相对保守,仍应继续加强监测。

H3N2亚型猪流感病毒HA1、HA2基因的原核表达及抗原性分析

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的一个重要蛋白,在疾病预防和治疗中具有重要作用。本试验旨在克隆和表达H3N2亚型猪流感病毒A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的HA1和HA2基因。用含有H3N2亚型SIV的鸡胚尿囊液提取RNA,RT-PCR扩增后将目的基因定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,并将其转入宿主菌BL21(DE3)pLyS进行表达,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测并用该病毒重组HA蛋白制备的特异性单克隆抗体1C10作为一抗对两种蛋白进行Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,得到HA1和HA2大小分别为34.8、23.2ku的重组蛋白,Western blotting结果表明,HA1蛋白与1C10单克隆抗体具有良好的反应原性,且1C10单克隆抗体表位在HA1蛋白上。本试验结果为进一步研究血凝素蛋白的结构和功能,以及建立快速诊断方法和基因工程疫苗提供材料。

H3N2亚型犬流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种H3N2亚型犬流感病毒(CIV)血清学检测方法,本研究利用CIV重组HA1蛋白作为检测抗原,建立H3N2亚型CIV抗体的间接ELISA检测方法,并优化反应条件。通过检测阴性血清样本30份确定其临界值为0.228。该方法与抗猪流感病毒H1N1、H1N2、H6N6、H9N2的阳性血清和犬瘟热病、犬细小病、犬副流感的阳性血清均无交叉反应。变异系数在1.01%～7.52%之间,具有较好的重复性。通过对150份临床样品进行检测并与血凝抑制试验检测结果比较,总符合率为98.6%。本研究为CIV流行病学调查提供了一种快速、方便、敏感的抗体检测方法。

2014-2015年商洛市流感病毒H3N2亚型血凝素(HA1)基因进化研究

目的分析2014-2015年度商洛市流感监测病毒血凝素(HA)基因变异情况并研究与推荐疫苗的匹配性。方法收集2014-2015年商洛市流感监测平台用狗肾传代细胞(MDCK)培养分离的H3N2亚型毒株,利用RT-PCR方法扩增分离HA片段,进行核苷酸序列测定,应用clustax2.1软件进行序列比对后,用Mega6.0软件构建系统发育进化树,系统进化树采用Neighboring-joining方法进行分析。结果 2014-2015年度分离的流感H3N2毒株同源性在97.2%~99.9%,与推荐疫苗株A/Texas/50/2012同源性为97.3%~98.5%;将分离毒株的HA1基因氨基酸与疫苗株比较,发现2014年毒株主要抗原决定簇氨基酸变异点有B区Y159F、S198P;2015年主要抗原决定簇氨基酸变异点有A区G142R,B区S159F、S198P。结论2014-2015年度商洛市流感H3N2亚型毒株关键抗原决定簇已经出现改变,A/Texas/50/2012作为疫苗组分已经不是最佳,亟需对我国流感H3N2亚型疫苗组分进行更新,应密切关注流感H3N2基因进化趋势。

H3N2亚型猪流感病毒HA和HA1蛋白的原核表达

为原核表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的HA和HA1蛋白,通过RT-PCR方法获得SIV的HA和HA1基因,克隆至原核表达载体pMAL-c5X,并转化至原核表达菌Rosetta(DE3)中,表达菌经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,成功表达了H3亚型SIV的HA和HA1蛋白,目的蛋白均以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,并与H3N2亚型SIV的HA单克隆抗体反应,说明HA和HA1蛋白具有良好的反应原性。