线粒体电压依赖性阴离子通道1在阿尔茨海默病发生机制中的作用

线粒体电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)是存在于线粒体外膜上的一系列孔道蛋白,其亚型之一VDAC1参与线粒体通透性转换(MPT)孔道的功能发挥,调控阳离子、阴离子、ATP、无机磷酸盐以及其他代谢产物进出线粒体。研究发现,随着阿尔茨海默病(AD)的发生发展,VDAC1蛋白表达水平提高,且其与β-淀粉样蛋白(Aβ)及磷酸化tau蛋白相互作用,干扰ATP/ADP、蛋白质等代谢产物的转运。现就VDAC1的结构、特性以及在AD发病中的机制作一综述。

细胞凋亡及与线粒体电压依赖性阴离子通道1的联系在阿尔茨海默病中的研究进展

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性认知功能下降和行为能力受损为特征的中枢神经系统退行性疾病。病理特征主要表现为β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成老年斑及微管相关蛋白tau蛋白异常高度磷酸化导致神经原纤维缠结(NFTs),也包括突触细胞丢失、异常神经元变性坏死等[1,2]。细胞凋亡主要是一种由基因调控的细胞发生程序化死亡现象,在生物体内细胞凋亡必不可少。胚胎正常发育过程中,生理性细胞凋亡负责清除局部细胞及受损的异常细胞来维持组织细胞稳态。

大鼠VDAC1腺病毒过表达载体构建及功能鉴定

目的构建电压依赖性阴离子通道蛋白1(VDAC1)腺病毒过表达载体,并观察其在H9C2细胞中的表达情况,为探究VDAC1在心肌细胞缺血再灌注损伤中的作用机制奠定基础。方法构建ADV6-NC腺病毒及ADV6-VDAC1腺病毒,取第6代H9c2心肌样细胞用于转染。转染细胞分为3组:空白对照组、阴性对照组(转染ADV6-NC腺病毒)和实验组(转染ADV6-VDAC1腺病毒)。通过qPCR和蛋白免疫印迹实验检测各组细胞VDAC1的表达情况。结果成功构建ADV6-NC及ADV6-VDAC1,实验组的VDAC1表达量明显高于空白对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论利用腺病毒载体可使H9c2细胞在体外持续高效表达VDAC1。

HK2和VDAC1在二乙酰吗啡致心肌细胞凋亡中的作用

目的探讨HK2和VDAC1在二乙酰吗啡致心肌细胞凋亡中的作用。方法采用剂量递增方法,建立二乙酰吗啡成瘾大鼠模型。将40只SD大鼠随机分为3组,正常组(Control,n=10)皮下注射等量生理盐水;模型组(Model,n=15)首次皮下注射二乙酰吗啡剂量为5 mg/kg,以后逐日递增剂量2.5 mg/(kg·d),连续注射20 d;模型+10 D组(Model+10D,n=15)在模型组基础上继续递增剂量至第10天。采用ELISA法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)含量;采用HE染色观察各组心肌组织病理变化;采用TUNEL染色检测各组心肌组织细胞凋亡;采用免疫组化、RT-qPCR和Western blot检测HK2、VDAC1及凋亡相关因子的mRNA和蛋白的表达变化。结果HE染色发现随着二乙酰吗啡干预时间的延长,心肌组织表现出不同程度的损伤。与正常组相比,模型组中血清LDH、GOT含量及心肌凋亡率升高,HK2和抗凋亡因子Bcl-2的mRNA和蛋白水平下降,VDAC1和促凋亡因子Bax、Caspase-3的mRNA和蛋白水平升高,Clevead Caspase-3蛋白水平升高;与正常组相比,模型+10 D组中以上指标,差异有统计学意义(P<0.05)。结论二乙酰吗啡可导致心肌细胞凋亡,HK2和VDAC1可能参与了二乙酰吗啡致心肌细胞凋亡的过程。

IP3R1调控CaMKⅡ和VDAC1在海洛因致心肌细胞节律异常中的作用

目的:探讨1,4,5-三磷酸肌醇1型受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1,IP3R1)调控钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)和电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)在海洛因(heroin,HE)致心肌细胞节律异常中的作用。方法:联合蛋白组学和GEO(Gene Expression Omnibus)数据库分析心律失常芯片数据,寻找关键调控因子。构建IP3R1基因敲减慢病毒并感染原代乳大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs),实验分为对照(control)组、HE组和HE+shIP3R1组。结晶紫染色观察心肌细胞形态;ELISA法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平;透射电镜观察线粒体形态学变化;Fluo-4/AM探针法检测细胞内Ca^(2+)浓度;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;JC-1染色法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)水平;ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平;免疫共沉淀(co-immunopre-cipitation,Co-IP)分析IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1蛋白之间的相互作用;Western blot检测IP3R1、CaMKⅡδ、p-CaM-KⅡδ(T287)和VDAC1的蛋白水平。结果:结合蛋白质组学和基因表达谱数据集GSE89410分析,筛选得到80个差异共表达分子,基于基因本体论(Gene Ontology,GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析结果,最终筛选出关键因子IP3R1,且通过STRING数据库获得IP3R1结合蛋白:CaMKⅡδ和VDAC1。Co-IP结果验证IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1存在相互作用,且HE干预后NRCMs中IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1之间的相互作用增强。体外细胞实验显示,与control组相比,HE组NRCMs数量急剧减少,细胞膜变窄,伪足减少,细胞核结构模糊;LDH和AST水平均显著上升(P<0.05);线粒体超微结构损伤严重,证实HE对NRCMs具有毒性作用并导致线粒体损伤。与control组相比,HE组心肌细胞内Ca^(2+)浓度、ROS水平、MMP以及IP3R1、p-CaMKⅡδ(T287)和VDAC1蛋白水平均显著升高(P<0.05),而HE+shIP3R1组这些指标均显著减低(P<0.05);ATP水平则相反。这证实沉默IP3R1表达可减轻HE干预后NRCMs的钙超载及线粒体损伤。结论:IP3R1通过调控CaMKⅡ和VDAC1引起心肌细胞钙超载和ROS生成增多,参与HE诱导的心肌细胞节律异常。

纳升电喷雾串联质谱鉴定吗啡依赖2个重要相关蛋白的N端乙酰化修饰

目的:用纳升电喷雾串联质谱(nanoESI-MS/MS)鉴定吗啡依赖相关蛋白。方法:采用吗啡递增给药法建立吗啡依赖模型,用纳洛酮催促后出现典型的戒断症状,以盐水组为对照,对长期接受吗啡处理和纳洛酮催促戒断这2种状态的大鼠纹状体进行了比较蛋白质组研究,确定了33个差异点。其中差异点150和209用电喷雾串联质谱进行了氨基酸序列分析。结果:电喷雾串联质谱分析表明差异点150和209为2个重要的吗啡依赖蛋白质:G 蛋白β1亚基和电压依赖型阴离子通道蛋白1(VDAC-1),并且这2个蛋白质都发生了 N 端乙酰化修饰。结论:纳升电喷雾串联质谱分析是研究蛋白质 N 端乙酰化的好方法。N 端乙酰化对蛋白质生物学功能有重要作用。这2个蛋白质 N 端乙酰化的生物学功能及其与吗啡依赖的关系值得深入研究。

天麻素调控PINK1/Parkin-VDAC1信号改善CoCl2诱导的HT22细胞凋亡

目的:探讨天麻素对二氯化钴(CoCl2)诱导的HT22细胞凋亡作用机制。方法:体外建立CoCl2损伤HT22的细胞模型。分组为空白组,模型组,天麻素低、中、高剂量组,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率、JC-1检测线粒体膜电位(MMP)、DCFH-DA检测活性氧(ROS)水平、二硫代硝基苯甲酸(DTNB)检测谷胱甘肽(GSH)含量;VDAC1基因过表达以及使用Parkin活性抑制剂后,Western Blot检测凋亡相关蛋白表达水平。结果:天麻素降低HT22细胞凋亡率,抑制HT22细胞MMP降低,抑制HT22细胞ROS水平升高和GSH含量降低。Western Blot显示,天麻素抑制PINK1、Parkin和VDAC1表达,同时也能降低凋亡相关蛋白(Bax/Bcl-2比率、Cleaved-Caspase 3、Caspase 3、Cytochrome-c)表达水平;VDAC1过表达以及使用Parkin活性抑制剂Suramin后,PINK1与Parkin的蛋白表达水平不受影响,天麻素仍然表现出抑制凋亡相关蛋白水平的作用。结论:天麻素可能通过抑制PINK1/Parkin-VDAC1信号下调HT22细胞凋亡水平。

黄芪注射液对血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2细胞凋亡的抑制作用和机制研究

目的:探讨黄芪注射液对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的H9c2心肌细胞凋亡的抑制作用及其可能作用机制。方法:采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)方法筛选H9c2细胞培养的黄芪注射液浓度;H9c2细胞分为正常对照组、AngⅡ模型组、AngⅡ+黄芪注射液组。采用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测3组H9c2细胞电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)及分子伴侣葡萄糖调节蛋白75(GRP75)mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测VDAC1、Mfn2、GRP75的蛋白表达;Fura-2 AM法测定细胞内Ca^(2+)浓度变化;用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果:黄芪注射液在浓度为0.125%时对细胞的促增殖作用最为显著。与正常对照组比较,AngⅡ模型组Mfn2、GRP75 mRNA表达水平明显增加(P<0.05),AngⅡ+黄芪注射液组Mfn2、GRP75 mRNA表达低于AngⅡ模型组(P<0.05或P<0.01),而3组VDAC1 mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,AngⅡ模型组VDAC1、Mfn2和GRP75的蛋白表达明显增加(P<0.05或P<0.01),AngⅡ+黄芪注射液组VDAC1、Mfn2、GRP75的蛋白表达低于AngⅡ模型组(P<0.01)。与正常对照组比较,AngⅡ模型组细胞钙含量、细胞凋亡率明显增加(P<0.05或P<0.01),AngⅡ+黄芪注射液组细胞钙含量、细胞凋亡率低于AngⅡ模型组(P<0.01)。结论:黄芪注射液能够抑制血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2心肌细胞凋亡,其机制可能与其调节VDAC1、Mfn2和GRP75等MAM结构蛋白表达和影响细胞内钙平衡有关。

灯盏细辛通过VDAC1/ROS/NLRP3通路减轻H_(2)O_(2)诱导的心肌细胞损伤

目的 探讨灯盏细辛(EB)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的心肌细胞损伤的影响及其作用机制。方法 建立体外H_(2)O_(2)诱导的心肌细胞氧化应激损伤模型。将体外培养的HL-1小鼠心肌细胞分为空白组(常规培养)、对照组(4 mg·L^(-1) EB 1 h)、模型组(800μmol·L^(-1) H_(2)O_(2) 1 h)、实验组(4 mg·L^(-1) EB+800μmol·L^(-1) H_(2)O_(2) 1 h)。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞活力;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞损伤情况;用流式细胞术检测活性氧(ROS)含量;用蛋白质印迹法检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、消皮素D(GSDMD)和电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)蛋白表达水平;用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测白细胞介素-1β(IL-1β)含量;用钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein AM)检测线粒体通透性转换孔(mPTP)的开放程度。结果 空白组、对照组、模型组和实验组的细胞活力分别为(93.58±7.33)%、(95.18±4.24)%、(52.20±6.98)%和(74.80±5.33)%;LDH释放量分别为(44.18±6.36)、(46.16±5.01)、(689.60±124.00)和(365.60±87.79)U·L^(-1);ROS释放量分别为0.97±0.10、0.97±0.05、5.18±0.21和3.08±0.41;NLRP3蛋白表达水平分别为0.98±0.06、0.99±0.01、1.98±0.19和1.60±0.17;GSDMD蛋白表达水平分别为1.00±0.07、1.00±0.05、1.97±0.09和1.46±0.10;IL-1β释放量分别为(25.39±5.35)、(25.02±2.37)、(214.8±35.90)和(117.50±23.66)pg·mL^(-1);VDAC1蛋白表达水平分别为1.00±0.04、1.01±0.05、3.18±0.15和1.80±0.18;30 min的mPTP孔开放水平分别为1.22±0.02、1.22±0.01、1.14±0.02、1.17±0.01。模型组上述指标与空白组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);实验组上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 灯盏细辛减轻H_(2)O_(2)诱导的HL-1心肌细胞损伤,其机制可能与通过VDAC1调节ROS/NLRP3通路有关。

参芪扶正注射液对结肠癌小鼠恶液质后骨骼肌线粒体功能的影响

目的 探讨结肠癌恶液质小鼠骨骼肌中线粒体功能变化及参芪扶正注射液干预后的影响。方法 将40只雌性BLAB/c裸鼠随机分为对照组、模型组及参芪扶正注射液低、高剂量组,每组10只。除对照组外,其余各组均ip人结肠癌Lovo细胞,并饲养至肿瘤广泛转移,制备癌症恶液质动物模型;根据消瘦程度和体质量变化监测各组小鼠癌症恶液质状态,ip给予参芪扶正注射液低、高剂量,每3天给药1次,连续给药7次。21 d后观察小鼠体质量变化,检测腓肠肌中三磷酸腺苷(ATP)、丙二醛(MDA)水平;Western blotting法检测小鼠腓肠肌中线粒体相关蛋白4-羟基壬烯酸(4HNE)、PPARγ共激活因子-1(PGC-1)、电压依赖型阴离子孔道蛋白(VDAC1)的表达情况。结果 与对照组比较,模型组与参芪扶正注射液干预组小鼠均出现癌症恶液质状态;与对照组比较,模型组小鼠腓肠肌ATP水平下降,MDA合成增多,腓肠肌线粒体相关蛋白4HNE和PGC-1表达水平均升高(P<0.05),VDAC1表达无明显差异;与模型组比较,参芪扶正注射液组小鼠腓肠肌ATP水平升高,MDA合成减少,腓肠肌线粒体相关蛋白4HNE和PGC-1表达水平均降低(P<0.05),VDAC1表达亦无明显差异。结论 参芪扶正注射液可以明显改善结肠癌腹腔转移小鼠的恶液质状态,可能与调节腓肠肌中线粒体功能、减轻线粒体氧化损伤有关。