调控T型钙通道Ca_v3.1电压依赖性失活的分子结构域(英文)

T型钙通道（Cav3）广泛分布于各类细胞,其显著的电生理学特点是低电位激活和快速的电压依赖性失活.失活在通道的生理功能调节中起十分重要的作用,但具体参与通道失活的分子基础目前并不完全清楚.为明确Cav3.1通道中调控电压依赖性失活的结构域,用Cav1.2通道（无电压依赖性失活）结构域Ⅰ和Ⅱ中的S1-S4、S5-S6区及Ⅰ和Ⅱ间的联系区替换Cav3.1中的相应区域,构建嵌合通道,并在卵母细胞中表达,用电压钳技术分析通道的电生理学特性.结果表明,替换Ⅰ中的S1-S4或S5-S6区可使Cav3.1的失活特性显著改变,但这种改变主要是由激活-失活偶联所致.Ⅱ的替换使通道的失活曲线参数发生显著改变,表明结构域Ⅱ,包括S1-S4和S5-S6均参与Cav3.1失活过程的调控.Ⅰ、Ⅱ间的联系区及Ⅰ中的S5-S6主要调控Cav3.1的失活速率,Ⅰ和Ⅱ中的S1-S4对通道失活速率无影响.综上所述,结构域Ⅱ是调控Cav3.1电压依赖性失活的关键因素,结构域Ⅰ不参与该通道失活过程的调控.Ⅰ、Ⅱ间的联系区及Ⅰ中的S5-S6主要调控Cav3.1通道的失活速率,Ⅰ、Ⅱ中的S1-S4对通道失活速率无影响.

屈膝点按叩揉法调控L型电压依赖性钙通道影响软骨细胞代谢的机制研究

[目的]通过分析屈膝点按叩揉法调控L型电压依赖性钙通道影响软骨细胞合成代谢,探讨该手法防治膝骨性关节炎(KOA)的分子机制。[方法]50只新西兰大耳白兔随机分成5组,运用Hulth造模法构建KOA兔模型,治疗组采用屈膝点按叩揉法治疗,阳性对照组采用关节腔注射玻璃酸钠注射液治疗,正常组、假手术组及模型组同条件饲养。通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测L型电压依赖性钙通道α1亚基及合成代谢相关蛋白的表达。[结果]治疗组、阳性对照组Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4、PTHr P、ColⅡ蛋白的表达均高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05),治疗组Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4、PTHr P、ColⅡ蛋白的表达与阳性对照组相比无统计学差异(P>0.05)。[结论]屈膝点按叩揉法通过影响L型电压依赖性钙通道蛋白,增加细胞内钙离子浓度,上调甲状旁腺激素相关蛋白(PTHr P)的表达,进而发挥促软骨细胞合成代谢的作用。

正常人类精子电压依赖性钙通道类型的分子生物学鉴别

目的:利用分子生物学技术对正常人类精子中电压依赖性钙通道的类型进行鉴别。方法:根据WHO标准用计算机辅助精液分析筛选出5例正常精子标本(前向运动精子>60%,活率>80%),混合后用上游法对精子进行优化。采用RT-PCR检测人类精子中电压依赖性钙通道的α亚单位。结果:α1A和α1D未检测出,而其他α亚单位,如α1H、α1G、α1E、α1B、α1C均有表达。结论:在正常人类精子中电压依赖性钙通道显著表达T型或非L型RNA,在精子运动和精子顶体反应中,细胞外的钙离子内流可能是通过T型或非L型电压依赖性钙通道介导的。

非肽类N型电压依赖性钙通道阻断剂的评价及ZC88的药理学研究

阿片类镇痛药的耐受性和依赖性严重限制了这类药物的临床应用，因此开发非成瘾性的强效镇痛药成为发展趋势；其中非肽类N型电压依赖性钙通道阻断剂是国外研究热点之一。本研究以4-氨基哌啶为母核，通过模拟ω-芋螺毒素MVIIA（Ziconotide．SNX-111）的空间结构，设计合成了113个新结构的非肽类N型钙通道阻断剂候选化合物。在小鼠醋酸扭体模型中，28个化合物的口服镇痛活性超过50％（40ms／kg）；电生理研究显示，8个化合物对N型钙通道钙电流的抑制率超过80％（50μM）；^3H—diprenorphine放射配体-受体竞争结合实验显示，大多数化合物不与阿片受体结合。相关分析发现，化合物的镇痛强度与其对N型钙通道的阻断能力有一定相关性。对较高镇痛活性和N型钙通道阻断能力的部分候选化合物进行早期药代动力学性质预测；选择药代动力学性质优良的4个化合物在大鼠糖尿病性神经痛模型中进一步评价，发现均对机械刺激痛觉超敏均产生明显的镇痛作用（100mg／kg，po）。对ZC88进一步研究发现，ZC88可逆性地作用于N型钙通道的静息态和失活态，其IC50为0．45±0．10μM，而对L型和P／Q型钙通道、NMDA受体、电压依赖性钠通道、瞬时外向钾电流、延迟整流钾电流均没有影响（100μM）；ZC88不仅对急性疼痛和慢性神经痛有明显镇痛作用，而且能够剂量依赖性地增强吗啡镇痛、对抗吗啡耐受和依赖；ZC88的急性毒性较低，LD50为1．40g／kg。

N型电压依赖性钙通道阻断剂镇痛作用研究进展

N型电压依赖性钙通道作为与疼痛密切相关的靶点,分布于伤害性信息传递的神经通路上,激活后通过引起钙离子内流而触发突触囊泡释放疼痛相关的神经递质,参与痛觉传导。阻断N型电压依赖性钙通道可以产生镇痛作用,特别是针对慢性疼痛。目前,针对该靶点的药物齐考诺肽已经上市,经鞘内给药用于治疗对吗啡镇痛耐受或无效患者的严重慢性疼痛,但其应用却受到给药途径及副作用的限制;因而具有口服镇痛活性的小分子N型电压依赖性钙通道阻断剂的研究越来越受到人们的重视。本文就相关研究进展进行综述。

体外培育牛黄抑制大鼠三叉神经节细胞电压依赖性钙通道电流参与镇痛机制

目的:研究体外培育牛黄(CBS)对大鼠三叉神经节(TRG)细胞电压依赖性钙通道电流(ICa)的影响,探讨牛黄镇痛作用的电生理机制。方法:在培养大鼠TRG细胞上采用全细胞膜片钳记录ICa。结果:CBS能够剂量依赖性地抑制TRG细胞电压依赖性钙通道电流,0.2,2,20μg.ml-1CBS可使钙电流幅值分别减少(30.3±4.7)%、(41.9±3.6)%和(56.7±6.8)%(n=6,P<0.01)。结论:CBS对钙电流的阻滞作用可能是其镇痛作用机制之一。

海刺参(Stichopus japonicus)电压依赖性钙离子通道β亚基基因及其编码产物的结构特点

电压依赖性钙离子通道(voltage-dependent calcium channels,VDCC)是细胞膜上控制Ca2+进入胞内的特殊蛋白质,VDCCβ亚基具有调节其通道活性的作用.使用RT-PCR和RACE PCR技术,从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到电压依赖性钙离子通道β亚基(SjCaβ)基因,所得序列提交GenBank,登录号EU853658.该基因全长1 867 bp,包含1个1 614 bp的开放阅读框(ORF),编码537个氨基酸.将SjCaβ与多种无脊椎动物钙离子通道β亚基进行分析比较,发现它们有较高的同源性,并具有钙离子通道β亚基基因内保守的2个功能区域,即SH3功能区(src-homology 3 domain)和GK功能区(guanylate kinase domain).在功能区域附近还具有电压依赖性钙离子通道β亚基特有的BID区(βinteraction domain),氨基酸保守序列为PYDVVP-RP---VGPSLKGYEVTDMMQKALFDF,进一步确定了得到的cDNA序列为海刺参电压依赖性钙离子通道β亚基.对SjCaβ的二级结构进行了预测,构建了系统进化发育树,并运用同源建模法构建了SjCaβ的三维结构模型.研究结果对深入研究海刺参离子通道的结构以及在信号传导过程中的作用有着重要意义,并为研究海刺参自溶等问题提供一定的理论基础.

大鼠动脉性和静脉性蛛网膜下腔出血对脑动脉平滑肌细胞电压依赖性钙通道电流的作用

目的探讨动脉性和静脉性蛛网膜下腔出血(SAH)对脑动脉平滑肌细胞电压依赖性钙通道(VDCCs)电流与动静脉血中氧合血红蛋白(Oxy Hb)浓度以及脑血流量的关系。方法取36只清洁级大鼠,在立体定向仪辅助下,采用鞍上池内注射自体动脉血或静脉血制作大鼠SAH模型。分为动脉性SAH(14只)、静脉性SAH组(13只)和假手术组(9只),并测定动脉血和静脉血Oxy Hb浓度。SAH模型建立后3 d,用膜片钳检测大鼠脑静息电位和VDCCs电流,用荧光微球法定量分析脑血流量(CBF)。结果 (1)动脉性SAH大鼠Oxy Hb水平明显高于静脉性SAH,分别为(127±4)、(54±6)g/L,假手术组为(50±5)g/L,3组比较差异有统计学意义(P<0.01)。(2)动脉性SAH组VDCCs最大电流明显高于静脉性SAH组和假手术组,分别为(3.22±0.31)、(2.19±0.27)、(2.18±0.29)p A(P<0.01)。动脉性SAH组VDCCs电流由L-和R-型构成,而静脉性SAH组电流仅由L-VDCCs构成。(3)动脉性SAH组脑血流量明显低于静脉性SAH组和假手术组,分别为(0.83±0.14)、(1.28±0.28)、(1.35±0.19)ml/(g·min)(P<0.01)。结论动脉性SAH对脑动脉平滑肌细胞VDCCs表达和功能的改变作用大于静脉性SAH,该差异可能与动静脉血中Oxy Hb等血管痉挛因子的浓度和成分差异有关。

木黄酮对小鼠胰岛β细胞电压依赖性钙通道表达和电流的影响

目的:研究长期抑制酪氨酸激酶活性对胰岛β细胞中电压依赖性钙通道的影响,探讨酪氨酸激酶在胰岛β细胞中的作用。方法:原代培养小鼠胰岛和胰岛β细胞,经0.1mmol/L酪氨酸激酶抑制剂木黄酮处理12h后,运用全细胞电流记录的方法观察电压依赖性钙电流以及动作电位的改变,RT PCR方法观察电压依赖性钙通道α1亚单位的表达改变。结果:木黄酮处理12h后,小鼠胰岛β细胞的电压依赖性钙电流明显减小(13.83±1.515pA/pF vs7.012±1.502pA/pF,P<0.01,n=6),动作电位幅度明显减弱(38.50±7.46mVvs15.95±4.39mV,P<0.01,n=6)。木黄酮处理12h后,小鼠胰岛中电压依赖性钙通道的α1亚单位的表达明显减少,降低为对照组的0.792±0.078(P<0.01,n=5)。结论:木黄酮处理可以抑制小鼠胰岛β细胞中电压依赖性钙通道的表达和电流,提示长期抑制酪氨酸激酶活性在胰岛β细胞功能损害中具有重要作用。

电压依赖性钙通道与β细胞功能

电压依赖性钙通道(VDCC)是生物体内一大类钙通道,随着膜电位的改变而出现通道的开放、关闭和失活,调节细胞内Ca2+浓度,最终产生生物学效应。其亚型结构各异,在胰腺、心、脑、肾上腺、视网膜及神经等组织器官均有不同程度的分布。VDCC存在的普遍性决定了其作用的广泛性。在胰腺β细胞上,VDCC亚型包括L-型钙通道和非L-型钙通道,对β细胞的钙电流均有贡献,且都参与了胰岛素的分泌过程,对胰岛素的分泌时相起调控作用。因此,了解β细胞中VDCC不同亚型的特点、分布及生物学作用,对阐明糖尿病的发病机制、寻找有效的治疗策略具有重要意义。

中枢神经系统L-型电压门控钙通道的功能调控与脑缺血

中枢神经系统L 型电压门控钙通道 (L typevoltage gatedcalciumchannels ,L VGCCs)由α1C(D)亚基和辅助亚基组成。α1C亚基的C 端包含多个功能结构域 ,可分别与钙调素、钙调蛋白酶、cAMP依赖性蛋白激酶、Src家族酪氨酸蛋白激酶 (Srcfamilyproteintyrosinekinases ,SrcPTKs)等相互作用 ,从而参与L VGCCs的功能调控。SrcPTKs介导的两种钙通道———L VGCCs和N 甲基 D 天冬氨酸 (N methyl D aspartate ,NMDA)

弱精子症患者精子中电压依赖性钙通道基因表达的变化

目的:探讨弱精子症患者精子中电压依赖性钙通道基因的功能性亚单位α1mRNA表达与弱精子症的关系。方法:首先根据WHO标准用计算机辅助精液分析(CASA)方法对供精者提供的精液进行筛选,然后用Per-coll非连续梯度离心法对精子进行优化,最后应用半定量反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别检测50例正常组成熟运动精子和50例弱精子症患者精子中各类型电压依赖性钙通道的α1mRNA相对表达量。结果:与正常成熟运动精子相比,弱精子症患者精子中电压依赖性钙通道的α1B(39.40±9.47)、α1C(48.30±11.60)、α1E(3.20±0.78)、α1G(8.40±2.03)、α1H(5.70±1.47)mRNA表达的差异具有极显著意义(P<0.01)。结论:L型和/或非L型电压依赖性钙通道的基因表达异常可能是导致人类精子运动能力下降的原因之一,为人类弱精子症病因提供了新的研究方向。

小鼠螺旋神经节细胞电压依赖性钙通道亚单位分析

目的 分析小鼠螺旋神经节细胞电压依赖性钙通道亚单位的类型。方法 手术分离新生小鼠的耳蜗螺旋神经节细胞进行培养,24 h后提取RNA。逆转录后获得螺旋神经节细胞cDNA,根据电压依赖性钙通道7种亚单位序列设计的引物进行聚合酶链反应扩增,通过聚合酶链反应结果分析和DNA测序确定螺旋神经节细胞表达的亚单位类型。结果 逆转录聚合酶链反应扩增出α1D、α1E、α2/δ、β1和β3亚单位的片段,测序进一步证明小鼠螺旋神经节细胞中有这几种亚单位的存在。结论 小鼠螺旋神经节细胞中有α1D、α1E、α2/δ、β1和β3亚单位的表达。α1D和α1E亚单位的共表达证明在哺乳动物的螺旋神经节细胞中有L型和R型电压依赖性钙通道。

铅对三叉神经细胞胞内游离钙[Ca^(2+)]_i及电压依赖性钙通道I_(Ca)的影响

目的观察铅对SD大鼠三叉神经细胞内游离钙的影响及其对电压依赖性钙通道作用,以探讨铅对三叉神经细胞毒性作用的机制。方法用全细胞膜片钳方法检测铅对三叉神经细胞电压依赖性钙通道的作用,并用激光共聚焦和FLUO-3/AM荧光探针标记技术,从单个细胞水平检测铅对胞内游离Ca2+瞬间动态变化的影响。结果铅可致三叉神经细胞内游离钙[Ca2+]i升高,铅又可抑制三叉神经细胞电压依赖性钙通道电流ICa。结论铅致三叉神经细胞内游离钙[Ca2+]i升高作用与胞内钙库释放有关;铅抑制三叉神经细胞电压依赖性钙通道ICa作用与其抑制高电压激活(HVA)钙通道有关。

窦房结组织及L-型电压门控钙通道蛋白表达的增龄性变化

为了检测窦房结不同区域L 型电压门控钙通道蛋白在窦房结增龄性中的变化 ,进一步阐明病窦综合征的病因及发病机制 ,我们采用异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素 生物素复合物技术 ,利用激光共聚焦显微镜测定幼年兔组 (1～ 2周龄 )、成年兔组 (5～ 6月龄 )和老年兔组 (40～ 70月龄 )窦房结组织不同区域L 型电压门控钙通道蛋白荧光强度。结果 :光镜下 ,幼年兔组的窦房结组织细胞最密集 ,成年兔次之 ,老年兔最少 ,老年兔有细胞核固缩、裂解现象 ,幼年组、成年组和老年组细胞数分别为 :2 6 .4 0± 3.2 7,15 .6 0± 2 .88,11.10± 1.91,其中两两比较 ,均有显著性差异 ;三个年龄组的兔窦房结组织的L 型电压门控钙通道蛋白荧光强度在外周区与中心区均有显著性差异 ,除了成年组 ,余年龄组的交界区与中心区表达也有明显差异 ;幼年组和成年组在窦房结中心区表达的L 型电压门控钙通道蛋白荧光强度具有显著性差异 (49.95± 5 .74vs 6 0 .5 5± 10 .5 4 ,P <0 .0 1)。结论 :兔窦房结组织细胞数随年龄增加而逐渐减少 ,并且在老年兔组出现核固缩、裂解现象 ;兔窦房结表达的L 型电压门控钙通道蛋白具有异质性 ;从出生到成年 ,兔窦房结组织中心区表达的L 型电压门控钙通道蛋白随年龄增长而增加 ,但在成年后无明显变化。

大鼠耳蜗α_(1D)L-型电压门控钙通道组织特异性异构体的剪切方式及其意义

目的 研究α1DL 型电压门控钙通道基因在大鼠耳蜗的剪切 (splicing )方式及其意义。 方法 以显微解剖取材的大鼠耳蜗基底膜为起始材料 ,利用外显子特异性 (exon specific)引物的RT PCR扩增和序列测定确定耳蜗表达的α1DL 型电压门控钙通道的剪切方式。结果 耳蜗表达的α1D钙通道cDNA剪切部位发生在功能域Ⅰ、Ⅱ之间的细胞内连接区和羧基末端。结论 大鼠耳蜗存在α1D钙通道组织特异性的剪切异构体 。

电压依赖性钙通道的α_2δ亚基和疾病及药物靶点的关系

目的介绍电压依赖性Ca2+通道(Cav)的亚单位之一α2δ的结构和功能以及与疾病的关系。方法对近期文献进行综述。结果电压依赖性Ca2+通道由5个亚单位组成。α2δ亚基由α2与δ亚基联接,共同对组成通道孔道的α1亚基进行辅助,以调解外钙内流。介绍了α2δ亚基的结构和在体内的分布,以及与疾病的关系(尤其是癫痫、偏头痛和神经源性疼痛)。gabapentin类药物是α2δ1和α2δ2亚基的小分子配体,通过α2δ亚基起治疗作用。结论α2δ亚基与疾病有关联,也是电压依赖性钙通道的分子靶点,值得进一步研究。

硝苯地平调控JunB表达拮抗敲除L-型电压依赖型钙通道H9c2细胞缺氧/复氧损伤的研究

目的:探讨硝苯地平(Nif)通过调控JunB的表达拮抗敲除L-型电压依赖型钙通道(Cacna1C^(-/-))H9c2细胞缺氧/复氧(H/R)损伤。方法:建立Cacna1C^(-/-) H9c2细胞H/R损伤模型,用Nif处理细胞。Western Blot检测细胞中JunB和Cleaved caspase-3蛋白的表达,Real-time PCR检测细胞中白介素-6(IL-6)mRNA的表达,比色法测定细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活力。结果:H/R增加细胞中JunB的表达,Nif能够降低细胞H/R状态下JunB的高表达,减少Cleaved caspase-3和IL-6的表达,抑制LDH从细胞中漏出。结论:Nif能通过调控Cacna1C^(-/-) H9c2细胞中JunB的表达拮抗心肌细胞H/R损伤。

硝苯地平对心室肌细胞L型钙通道状态依赖性阻滞的研究

目的探讨选择性L型钙通道阻滞剂硝苯地平对L型钙流[ICa(L)]浓度、状态依赖性阻滞作用的影响。方法采用膜片钳全细胞记录技术对豚鼠单个心室肌细胞,给予35℃的各种含药物细胞外液快速灌流,记录ICa(L)。结果①保持电位-80mV,硝苯地平抑制ICa(L)的IC50为0.3μmol·L-1;保持电位为-40mV时,IC50为0.05μmol·L-1,呈浓度依赖性阻滞。硝苯地平0.3μmol·L-1作用于电压依赖的ICa(L)失活曲线,使其左移17mV,至更负的膜电位,显示硝苯地平相对选择与失活态钙通道结合。②在10s的静息间隔药物作用时间后的第1个实验刺激,硝苯地平3μmol·L-1或30μmol·L-1加速ICa(L)的失活,提示硝苯地平对ICa(L)可能存在激活态阻滞。结论在生理条件下,硝苯地平对ICa(L)的阻滞呈浓度、状态依赖性。相对选择与失活态钙通道结合,且可能存在激活态阻滞。