电压门控氯通道3可促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移

目的探讨电压门控氯通道3(CLC-3)在人脑胶质瘤细胞的表达以及在其侵袭和迁移中的作用。方法采用免疫组织化学(免疫组化)技术,检测30例临床确诊并有完整资料的人胶质瘤病理切片和6例非胶质瘤正常人脑标本中CLC-3蛋白的表达情况,再通过ShCLC-3干扰腺病毒下调U87MG细胞株CLC-3的表达,运用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测胶质瘤细胞侵袭迁移情况,并进行统计学分析。结果 30例胶质瘤病理结果 WHO胶质瘤病理分级标准Ⅰ级6例、Ⅱ级9例、Ⅲ级7例、Ⅳ级8例;在高级别(Ⅲ～Ⅳ)胶质瘤细胞中染色呈明显棕黄色或棕褐色,在低级别胶质瘤(Ⅰ～Ⅱ)中染色呈淡黄色或棕黄色,在正常脑细胞中可见1例无着色,另外5例呈淡黄色;CLC-3蛋白的表达与性别、年龄无相关性(P均> 0.05)。Spearman秩相关分析结果显示CLC-3的表达与WHO胶质瘤病理分级呈正相关(rs=0.782,P <0.001)。通过ShCLC-3腺病毒感染胶质瘤细胞株U87MG后CLC-3表达降低,胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力减弱(P均<0.05)。结论 CLC-3在胶质瘤细胞中高表达并与其病理分级呈正相关,CLC-3可促进胶质瘤的侵袭和迁移。

缺氧缺糖/复氧复糖对大鼠皮质及海马神经元ClC-3氯离子通道表达的影响

目的:研究原代培养大鼠前额叶皮质和海马神经元缺氧缺糖/复氧复糖后电压门控氯离子通道3(voltage-gated chloride channel 3,ClC-3)在mRNA和蛋白水平的表达。方法:取原代培养8 d的大鼠皮质和海马神经元,随机分为对照组和模型组。模型组缺氧缺糖30 min后再复氧复糖,于复氧复糖后6、24、48、72 h采用反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)、Western blot技术检测ClC-3 mRNA及蛋白水平的表达。结果:原代培养大鼠皮质和海马神经元ClC-3 mRNA及蛋白水平呈低水平表达。缺氧缺糖/复氧复糖24 h后培养皮质神经元ClC-3mRNA及蛋白水平开始上调,48 h仍然高表达,72 h后下降(P<0.05)。海马神经元ClC-3 mRNA在缺氧缺糖/复氧复糖6 h后即开始升高,高峰持续从24～48 h(P<0.05),72 h下降至略高于正常水平(P<0.05)。海马神经元ClC-3蛋白在24 h后表达开始逐渐升高,至72 h仍高表达(P<0.05)。结论:C1C-3通道表达上调可能增强复氧复糖后细胞对氧化应激、炎性反应的同时也促进细胞凋亡。

慢病毒介导的干扰ClC-3肝癌稳定细胞株的建立及其侵袭和迁移能力的改变

目的建立慢病毒介导的靶向干扰电压门控氯通道3(voltage-gated chloride channel 3,Cl C-3)的稳定肝癌细胞株,并探讨其侵袭和迁移能力的改变。方法构建靶向Cl C-3的3个短发夹状RNA(short-hairpin RNA,sh RNA)慢病毒表达载体,293FT细胞包装慢病毒并测定滴度。重组慢病毒感染肝癌细胞株MHCC97H,筛选稳定干扰细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测Cl C-3 m RNA和蛋白的表达以确定干扰效率。Transwell小室实验(含Matrigel和不含Matrigel)和细胞划痕实验检测Cl C-3基因被抑制后侵袭和迁移能力的改变。结果成功获得4种慢病毒,感染MHCC97细胞后,建立1株阴性对照细胞和3株Cl C-3稳定干扰细胞(MHCC97H/sh Cl C-3-1、sh Cl C-3-2和sh Cl C-3-3)。3株稳定干扰细胞Cl C-3 m RNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照细胞(P<0.01),MHCC97H/sh Cl C-3-2细胞对Cl C-3的抑制效果最好。与阴性对照细胞相比,MHCC97H/sh Cl C-3-2细胞侵袭和迁移能力都下降(P<0.01)。结论成功建立稳定干扰Cl C-3基因的肝癌细胞株,Cl C-3表达抑制会降低MHCC97H细胞的侵袭和迁移能力。

耐药肿瘤细胞中ClC-3、P-gp的表达变化及相关性

目的观察电压门控氯通道3(Cl C-3)、P-糖蛋白(P-gp)在耐药肿瘤细胞中的表达变化,并探讨其相关性。方法提取人肝癌细胞株BEL-7402及其氟尿嘧啶耐药株BEL-7402/FU、人结肠癌细胞株HCT-8及其紫杉醇耐药株HCT-8/T的总RNA和蛋白,用荧光定量PCR法检测细胞Cl C-3和多药耐药基因1(MDR1)mRNA的表达,Western blotting法检测细胞Cl C-3蛋白和P-gp的表达,采用线性相关分析Cl C-3蛋白和P-gp表达的相关性。结果耐药细胞BEL-7402/FU和HCT-8/T中Cl C-3、P-gp的mRNA和蛋白水平都高于相对应的非耐药细胞BEL-7402和HCT-8(P均<0.05),在耐药肿瘤细胞中,Cl C-3蛋白与P-gp表达呈正相关(r=0.98,P<0.05)。结论 Cl C-3、P-gp在耐药肿瘤细胞中呈高表达,二者表达水平呈正相关关系。

ClC-3基因过表达对小鼠骨量和骨结构的影响

目的:研究过表达电压门控氯通道家族蛋白成员3(voltage-gated chloride channel family protein 3,ClC-3)基因对小鼠骨骼的影响。方法:3月龄雄性FVB小鼠用鼠尾基因检测法确定基因型后分为2组:野生型(WT)组和ClC-3过表达(ClC-3 transgene)组,每组各8只。分别测量2组小鼠体重,右侧胫骨长度和重量。取胫骨上段和中段进行脱钙,石蜡包埋,切片,HE染色后,采用骨形态计量学分析胫骨上段松质骨的骨小梁面积百分数(percent trabecular area,%Tb.Ar)、骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁宽度(trabecular width,Tb.Wi)、骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)和胫骨中段皮质骨的骨组织总面积(total tissue area,T.Ar)、皮质骨面积(cortical area,Ct.Ar)、皮质骨面积百分数(percent cortical area,%Ct.Ar)、骨髓腔面积(marrow area,Ma.Ar)、骨髓腔面积百分数(percent marrow area,%Ma.Ar)。结果:小鼠经鼠尾基因检测后确认为野生型或ClC-3过表达型。与WT组相比,ClC-3 transgene组小鼠体重及胫骨长度重量均减小(P<0.05);松质骨的%Tb.Ar和Tb.Wi均减小(P<0.05),Tb.Sp增大(P<0.05),Tb.N的变化无统计学意义;皮质骨的T.Ar、Ct.Ar和%Ct.Ar均减小(P<0.05),%Ma.Ar增大(P<0.05),Ma.Ar的变化无统计学意义。结论:ClC-3过表达导致小鼠的皮质骨和松质骨骨量减少,骨结构变差,提示ClC-3可能参与了骨形成和/或骨吸收。

ClC-3在大鼠异位心脏移植急性排斥期的表达及意义

目的观察电压门控氯通道-3(C lC-3)在大鼠异位心脏移植急性排斥期中的表达及意义。方法以SD大鼠为供者,W istar大鼠为受者,建立大鼠腹部心脏异位移植模型,分为两组,每组32对。对照组:用生理盐水灌胃;环孢菌素A(C sA)组:用C sA灌胃干预。每组8只观察移植心存活时间,术后1、3、5和7d各切取6只标本,常规组织切片监测排斥反应,以原位末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测移植心肌组织C lC-3的表达。结果C sA组移植心存活时间明显长于对照组(15.4±5.1d vs.7.6±1.5d,P<0.05);C sA组各采样时段的免疫排斥反应分级及心肌凋亡指数明显低于对照组(P<0.05),而C lC-3表达强度均强于对照组(P<0.05)。C sA干预能明显降低免疫排斥反应分级及心肌凋亡指数,改善C lC-3表达强度的降低。结论移植心脏中C lC-3表达水平的高低与心脏急性免疫排斥反应的轻重及心肌细胞凋亡指数的高低密切相关,提示C lC-3在移植心脏免疫排斥反应心肌细胞凋亡坏死中有着重要的作用。

ClC-3在神经病理性痛大鼠脊髓背角及背根神经节的表达及其参与痛行为调控的研究

目的:观察电压门控性氯通道(voltage-gated chloride channel,ClC)3型在腓总神经结扎神经病理性痛模型大鼠脊髓背角(spinal dorsal horn,SDH)和背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)内的表达变化及阻断氯离子通道后痛行为的改变。方法:应用免疫组织化学染色法、蛋白印迹法以及痛行为检测观察ClC-3在神经病理性痛大鼠SDH和DRG的变化和作用。结果:在正常大鼠,ClC-3主要位于DRG神经元胞膜;在SDH,ClC-3阳性纤维主要位于Ⅰ层。在腓总神经结扎大鼠,1周内结扎侧背角Ⅰ层及DRG的ClC-3表达增加,2～4周表达逐渐减少,在DRG也观察到相同的现象。给予氯离子通道阻断剂后,腓总神经结扎大鼠的痛阈下降。结论:ClC-3在神经病理性痛早期表达上调,随病程发展逐渐下降;阻断ClC-3可使大鼠痛阈下降。