孔道关键氨基酸残基对电压门控钾离子通道Kv2.1和Kv2.2离子选择性的调控

哺乳动物电压门控钾离子通道在膜电位维持以及介导神经元和肌肉兴奋性方面发挥了关键性的作用,与多种神经和心血管疾病密切相关.本研究主要运用点突变方法和膜片钳技术探究W366,Y376以及W374,Y384之间的氢键对哺乳动物大鼠Kv2.1和Kv2.2通道结构和功能的影响.实验证明破坏该氢键会导致通道丧失钾离子通透能力,而主要通透钠离子.

辅助亚基KChIPs对Kv4钾通道的“钳制”调节作用

快速失活电压门控型钾通道对于神经元兴奋性发挥重要的调节作用,从而影响神经元的功能,如疼痛的信号传导等。拥有四个钙结合位点"EF-hand"的胞浆蛋白KChIPs(Kv channel-interac-ting proteins)属于神经钙感受器(NCS)家族,与Kv4(Shal)的α亚基共组装成为天然复合体,在神经元和心肌分别编码瞬间低阈值A型K+电流ISA(transient subthreshold A-type K+ current)和瞬间外向K+电流ITO(transient outward K+current)。辅助亚基KChIPs与Kv4N端的特异性结合有助于电压门控钾通道四聚体的形成和稳定,从而增加通道向细胞膜表面的转运,并调节通道的失活动力学和恢复速率等。本文基于近期解析出的Kv4N末端与KChIP1的复合晶体结构,着重阐述Kv4钾通道与其辅助亚基KChIPs的相互作用机制。在Kv4N端/KChIP1复合结晶体中,每一个KChIP1分子分别与两个邻近的Kv4N末端相结合,即单个KChIP1同时与周围的两个Kv4相互作用,而形成分子数比为4:4的"钳制"结构。Kv4和KChIPs相互作用的结构机制为基于结构的化合物设计以及治疗膜兴奋性相关疾病提供了基础。

肺动脉高压与肺动脉平滑肌电压门控钾离子通道

肺动脉高压(PAH)是一种严重的心肺疾病,PAH的发病机制复杂多样,越来越多的证据支持钾离子通道在PAH中起重要的作用,肺动脉平滑肌钾离子通道表达减少和/或活性对PAH的建立和进展也有重要影响。本篇综述主要描述了肺动脉平滑肌细胞电压门控钾离子通道(Kv1.5)对调节PAH的分子机制和生理影响,该通道可能是治疗PAH的靶点。

Kv1.1及Kv1.3通道亚型对小鼠肠系膜微细动脉的调节作用

目的研究Kv1.1及Kv1.3通道亚型对小鼠肠系膜微细血管的调节作用。方法以健康6~8周C57BL/6雄性小鼠肠系膜微细动脉作为研究对象,应用丹麦DMT520A离体微血管张力测定系统记录血管张力变化。应用广谱电压依赖性钾通道(Kv)阻断剂4-AP,Kv1.3通道选择性阻断剂PAP-1,Kv1.1通道选择性阻断剂TEA分别作用于静息状态,KCl及NE预收缩动脉,记录血管张力变化情况。应用Kv通道阻断剂4-AP,Kv1.3通道选择性阻断剂PAP-1作用于血管,观察Kv及Kv1.3通道在0 mmol/L Ca^(2+)及2 mmol/L Ca^(2+)K-H液中对NE收缩曲线的作用。结果 Kv通道阻断剂4-AP可引起静息状态的血管收缩,并进一步收缩KCl预收缩的血管,但浓度依赖性舒张NE预收缩的动脉,并且与对照组相比,4-AP能明显抑制NE在0 mmol/L Ca^(2+)液中所致的血管收缩[(3.45±0.24)m N vs(0.11±0.02)m N,P<0.01]。Kv1.3通道选择性阻断剂PAP-1未能收缩静息状态的血管,但可使KCl预收缩的血管发生轻微舒张反应,却明显舒张NE预收缩的动脉,而且PAP-1既可抑制NE在0 mmol/L Ca^(2+)K-H液中所致的血管收缩[对照组vs PAP-1组:(4.28±0.53)m N vs(2.75±0.49)m N,P<0.05],又可抑制在2 mmol/L Ca^(2+)液中的收缩张力[对照组vs PAP-1组:(7.08±0.58)m N vs(5.90±0.80)m N,P<0.05]。Kv1.1通道选择性阻断剂TEA可引起静息状态的血管收缩,但在0 mmol/L Ca^(2+)液中该作用消失,同时对KCl或NE预收缩的动脉均无明显作用。结论 Kv通道可调节小鼠肠系膜动脉的舒缩反应。其中Kv1.1通道主要发挥血管收缩调节作用,可能与促进血管平滑肌细胞外钙内流有关,而Kv1.3通道主要发挥血管舒张调节作用,可能同时抑制平滑肌细胞内钙释放和细胞外钙内流。

二氯醋酸钠对模拟高原肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞Kv1.5亚型的作用研究

目的研究电压门控性钾通道亚型(Kv1.5)在高原低压低氧性肺动脉高压中的作用,观察二氯醋酸钠(DCA)对高原低压低氧性肺动脉高压大鼠肺小动脉平滑肌细胞(PASMCs)电压门控性钾通道Kv1.5亚型基因表达的影响和肺动脉高压的降压作用。方法24只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(N组,8只)、高原低压低氧组(HA组,8只)及DCA干预组(DCA组,8只)。N组置于平原处室内喂养,HA组和DCA组均同时置于模拟的海拔5000m高原环境,DCA组大鼠予以DCA70mg·kg-1·d-1灌胃。21d后测量三组大鼠平均肺动脉压(mPAP)、肺小动脉平滑肌和心脏壁厚度,用荧光定量PCR法检测三组大鼠PASMCs Kv1.5 mRNA,免疫组织化学和免疫印迹法观察大鼠PASMCsKv1.5蛋白的表达。结果模拟高原5000m21d后,HA组大鼠mPAP明显高于N组(P<0.01),其肺小动脉管壁增厚,管腔狭窄,表现为管壁厚度占外径的百分比(WT%)、管壁面积占总面积的百分比(WA%)和右心室与左心室加室间隔之比(RV/LV+S)较N组明显升高(P均<0.01)。与HA组相比,DCA组mPAP则明显降低(P<0.01),表现血管重构减弱,WT%和WA%明显下降(P<0.01),RV/LV+S下降(P<0.01)。HA组Kv1.5 mRNA明显低于N组(P<0.01),DCA组Kv1.5 mRNA则明显恢复表达(P<0.01)。HA组肺小动脉壁Kv1.5平均光密度低于N组(P<0.01),DCA组则明显高于HA组(P<0.01)。蛋白表达呈现相似结果。结论高原低压低氧性大鼠PASMCs Kv1.5表达明显受到抑制,DCA具有恢复Kv1.5表达、阻止肺小动脉重塑及降低肺动脉压的作用。

lncRNA KCNQ1OT1调控miR-384/CACNA1C轴对心肌细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA钾电压门控通道亚家族Q成员1反向转录物1(lncRNA KCNQ1OT1)调控miR-384/L型钙离子通道α1C亚基基因(CACNA1C)轴对心肌细胞增殖、凋亡的影响。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot分别检测正常培养的大鼠心肌H9c2、CP-R073细胞及缺氧/复氧(H/R)诱导的H9c2、CP-R073细胞中的KCNQ1OT1、miR-384、CACNA1C蛋白表达。将H9c2细胞分为Ct组、Model组、si-NC组、si-KCNQ1OT1组、mimic NC组、miR-384 mimic组、si-KCNQ1OT1+inhibitor NC组、si-KCNQ1OT1+miR-384 inhibitor组。除Ct组外,其他组H9c2细胞均需转染对应物质后构建H/R损伤模型。qRT-PCR检测细胞中KCNQ1OT1、miR-384表达;CCK-8法、EdU染色检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测细胞中肌红蛋白(Mb)、肌钙蛋白-Ⅰ(cTnⅠ)水平;Western blot检测CACNA1C、增殖细胞核抗原(PCNA)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证KCNQ1OT1与miR-384、miR-384与CACNA1C的关系。结果H/R诱导的H9c2、CP-R073细胞中KCNQ1OT1、CACNA1C蛋白表达升高,miR-384表达降低,且H/R诱导的H9c2细胞中KCNQ1OT1、CACNA1C蛋白表达最高,miR-384表达最低,因此,后续选择H9c2细胞为研究对象。与Ct组比较,Model组细胞中KCNQ1OT1、细胞凋亡率、Mb、cTnⅠ水平、CACNA1C、Caspase-3、Bax蛋白表达升高,miR-384表达、D 450值、EdU阳性率、PCNA蛋白表达降低(P<0.05);沉默KCNQ1OT1或过表达miR-384可促进H/R诱导的H9c2细胞增殖,抑制细胞凋亡;miR-384 inhibitor减弱了沉默KCNQ1OT1对H/R诱导的H9c2细胞增殖的促进作用,以及对细胞凋亡的抑制作用;KCNQ1OT1靶向调控miR-384/CACNA1C轴。结论沉默KCNQ1OT1可能通过上调miR-384来抑制CACNA1C表达,进而促进H/R诱导的H9c2细胞增殖,抑制细胞凋亡。

以癫痫为首发表现的KCNA1基因突变所致婴幼儿1型发作性共济失调1例并文献复习

目的总结以癫痫为首发表现的KCNA1基因突变所致1型发作性共济失调(EA1)的临床表型、基因型特点和治疗方法。方法回顾性分析1例以癫痫为首发表现的KCNA1基因突变所致EA1患儿的临床资料,以及家系外周血全外显子基因测序(WES)结果,检索中英文数据库中有关以癫痫为首发表现的KCNA1基因突变病例,总结其临床特征及基因突变谱。结果(1)本例患儿于1岁4个月起病,以反复抽搐为主要表现,头颅MRI检查无异常,左乙拉西坦治疗效果好,既往生长发育正常,频繁癫痫发作后出现认知倒退及共济失调表现。WES结果提示KCNA1基因c.877G>T杂合错义突变,其母亲及外公同样携带有该杂合变异,父亲及外婆未携带;母亲有癫痫发作史,其余家庭成员无相关表现。(2)共检索到14例国外报告的以癫痫为首发表现的KCNA1基因突变病例,其中11例明确癫痫发作后数月或数年伴发发作性共济失调或神经性肌强直,8例出现发育落后。结论(1)本文报告的KCNA1基因c.877G>T突变尚未见报告,补充了该基因突变位点数据库。(2)以癫痫为首发症状的EA1不易被发现。因此,对先出现婴幼儿期癫痫,后出现短暂性共济失调、肌强直、运动发育落后等症状,且头颅影像学无明显异常的患儿,需考虑EA1的可能,建议及时行基因测序协助诊断。(3)现有的抗癫痫药对于KCNA1基因突变导致的癫痫均有一定疗效。

二氯醋酸钠对大鼠低氧肺动脉高压的预防作用

目的研究二氯醋酸钠（DCA）对大鼠在高原环境下形成高原低氧性肺动脉高压的预防作用,以及对高原低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）上电压门控性钾通道亚型Kv2.1基因表达的影响和抑制肺动脉重构的作用方法24只雄性SD大鼠随机平均分为正常对照组（N组）、高原组（HA组）及DCA干预组（DCA＋HA组）。N组置于平原处室内喂养,HA组和DCA＋HA组均同时置于模拟的海拔5000 m高原环境,DCA＋HA组大鼠以DCA按70 mg/（k.gd）灌胃。21 d后测量3组大鼠平均肺动脉压（mPAP）,图像分析技术分析肺动脉（50~150μm）形态改变,用实时荧光定量PCR法检测3组大鼠PASMCs Kv2.1 mRNA,免疫组织化学法观察大鼠PASMCsKv2.1蛋白的表达。结果 HA组大鼠mPAP明显高于N组（P〈0.01）,其肺动脉管壁增厚,管腔狭窄,表现为管壁厚度占外径的百分比（WT%）和管壁面积占总面积的百分比（WA%）明显升高（P〈0.01）,HA组大鼠右心室肥厚指数（右心室/左心室＋室间隔,RV/LV＋S）较N组明显升高（P〈0.01）,而DCA＋HA组mPAP则明显比HA组低（P〈0.01）,并表现血管重构减弱,WT%和WA%明显低于HA组（P〈0.01）,RV/LV＋S下降（P〈0.01）。HA组Kv2.1 mRNA明显低于N组（P〈0.01）,DCA＋HA组Kv2.1 mRNA则明显恢复表达（P〈0.01）。HA组肺动脉壁Kv2.1平均光密度低于N组（P〈0.01）,DCA＋HA组则明显高于HA组（P〈0.01）,蛋白表达呈现相似结果。结论 DCA对于大鼠在高原条件下形成的肺动脉高压具有预防作用,同时能够上调大鼠PASMCs上Kv2.1表达,阻止肺动脉和右心室重构的作用。

良性家族性婴儿惊厥KCNQ2基因G271V突变体钾通道的功能研究

目的观察良性家族性婴儿惊厥相关基因KCNQ2突变体G271V的钾通道的功能,进一步探讨KCNQ2基因G271V突变的致病机理。方法将前期成功构建的突变体G271V或和Kv7.2及Kv7.3的真核表达载体转染进真核表达细胞(HEK293细胞),利用全细胞膜片钳技术检测G271V突变体的钾通道功能。结果转染HEK293细胞后,G271V突变体无电流产生,与野生型相比,激活电流明显下降,诱导电压门控去极化改变。G271V的最大激活电流密度为(2.47±0.41)pA/pF(n=12),Kv7.2的最大激活电流密度为(20.53±2.51)pA/pF(n=10),差异有统计学意义(P<0.001)。同时,突变体可以消除同源通道的电流改变,Kv7.2/Kv7.3的最大激活电流密度为(123.68±15.21)pA/pF(n=15),Kv7.2/G271V/Kv7.3的最大激活电流密度为(42.71±6.27)pA/pF(n=10),而G271V/Kv7.3的最大激活电流密度为(3.74±0.76)pA/pF(n=10),差异有统计学意义(P<0.05),突变体引起Kv7.2/G271V/Kv7.3异源通道电流减少约50%。结论 G271V突变体不能使钾通道开放去极化钾电流,突变体引起钾通道功能缺陷。