一种快速检测蛋白酶抑制剂电泳活性的染色方法

根据特异蛋白酶抑制剂抑制靶蛋白酶的作用而阻止水解的原理 ,借助明胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品 ,胶板经蛋白酶水解后 ,以考马斯亮蓝染色 ,建立了一种简便、直观、灵敏的检测蛋白酶 (胰蛋白酶 )抑制剂活性的染色方法 。

聚丙烯酰胺凝胶电泳活性染色法检测腺苷脱氨酶

本文建立了分离、检测腺苷脱氨酶（ＡＤＡ）酶谱的ＰＡＧＥ活性染色法。用此法检测了２４例正常人血清，７８例胸腔积液患者血清和胸水ＡＤＡ酶谱及其各谱带相对百分活性。结果：正常人血清以及患者血清和胸水ＡＤＡ可分出三个主要谱带；结核性胸膜炎患者血清和胸水ＡＤＡ带Ⅲ相对百分活性升高（Ｐ＜０．０１）。

活性电泳分析米曲霉沪酿3.042蛋白酶组分

建立了活性电泳分析蛋白酶组分的方法。在制备分离胶时,加入终浓度为0.5%的SDS和1%的酪蛋白,4℃下电泳,以2.5%Triton-X100洗去SDS,在不同条件下温浴,可得到清晰的蛋白酶谱。采用该方法在沪酿3.042的成曲浸提液中检测到7种蛋白酶组分,这些组分在pH中性条件下都有活性,其中3种蛋白酶在pH酸性条件下仍然有很强的活性。这些发现与对米曲霉蛋白酶的传统认识有很大的不同。

活性电泳切胶法分离白腐菌(Trametes sp.B1)2种漆酶同工酶及其性质研究

对白腐菌(Trametes sp.)菌株B1的固体发酵粗酶液进行活性电泳后发现含有5种漆酶同工酶。硫酸铵沉淀、离子交换柱层析和Sephadex G100柱层析的收集液中包含有2种带电荷和分子量接近的漆酶同工酶,进一步利用活性电泳切胶法纯化出这2种同工酶,用SDS-PAGE证明为单一漆酶,它们的分子量分别为64 ku(Lac1)和62 ku(Lac2),并对其理化性质进行了研究。Lac1漆酶反应的最适p H值为2.2,最适温度为50℃,氧化ABTS的Km值为1.952 mmol/L;Lac2漆酶反应的最适p H值为2.2,最适温度为40℃,氧化ABTS的Km值为0.255 mmol/L。

小白鼠发育过程中胃和大肠蛋白酶活性的变化

采用活性电泳方法对小白鼠发育过程中胃和大肠蛋白酶活性进行了研究。结果发现：（1）出生前，胃和大肠蛋白酶种类少，活性弱；出生后，胃和大肠蛋白酶的种类多，活性增加；（2）胃肠蛋白酶可能与其结构的构建和功能建立有密切关系；（3）食物的刺激可能对胃肠蛋白酶有显著影响。

大鵟消化系统蛋白水解酶种类和活性分析

采用蛋白水解酶复性电泳(G-PAGE)技术对大(Buteo hemilasius)消化系统5种器官腺胃、胰脏、十二指肠、空肠、大肠蛋白水解酶的种类和性质进行了研究,以期为研究野生鸟类的分类地位、系统演化提供基础资料,结果表明,①受pH值的影响和制约,大消化系统蛋白水解酶的活性在碱性、中性与酸性条件下递减;②在酸性条件下,45 ku蛋白水解酶存在于除腺胃外的各受检器官;③pH 7.0时,腺胃、胰脏酶谱相似,均含有683、5、342、0 ku的蛋白水解酶;④pH 8.0时,空肠和十二指肠的蛋白水解酶种类最多、活性最强,分别检出8种和7种蛋白水解酶。总之,pH值对蛋白水解酶的活性有明显的制约作用,46、41ku蛋白水解酶随着pH值的增高而失去活性,为酸性蛋白水解酶,250、2064、5 ku蛋白水解酶随着pH值的增高活性逐渐增强,为碱性蛋白水解酶。十二指肠和空肠的蛋白水解酶种类多、活性强,可能为蛋白质消化的主要场所。

运动训练对小鼠心肌蛋白酶活性的影响

采用活性电泳方法 ,研究了运动训练对小鼠心肌蛋白酶活性的影响。结果表明 :(1 )随着运动强度的增加 ,不同运动训练组小鼠心肌的中性和碱性蛋白酶活性有不同程度的升高。酸性条件下 ,未检测到蛋白酶活性 ;(2 )

黑斑蛙早期胚胎发育过程中蛋白酶活性

本文采用活性电泳方法，对黑斑蛙（Ｒａｎａ ｎｉｇｒｏｍ ａｃｕｌａｔａ）早期胚胎发育过程中蛋白酶活性进行了研究．结果如下：尾芽期以前未检测到蛋白酶活性；中性条件下，心跳期检出分子量分别为８０、７２、６６ｋＤ的三种蛋白酶；随着胚胎的发育，蛋白酶的种类逐渐增多、活性逐渐增强；三种ｐＨ 条件下各时期所检出的酶的种类及活性并不相同，但以中性条件下酶的种类多、活性强．

中华大蟾蜍尾退化过程中尾蛋白酶活性的变化

采用活性电泳方法对中华大蟾蜍尾退化过程中尾蛋白酶活性的变化进行了研究 ,结果显示 :(1)酸性条件 (p H3.5 )下 ,从 35期到 38期 ,检测到的蛋白酶带数目较少 ,活性较弱 ;碱性条件 (p H9.5 )下 ,除 2 5 k D的蛋白酶带之外 ,检测到的其它酶带与酸性条件下相似 ;(2 )中性条件 (p H7.0 )下 ,从 35期到 38期 ,检测到的蛋白酶带逐渐增多 ,活性也明显增强 ,尤其是在尾退化的高峰期 (37期、38期 ) ,110 k D、92 k D、 74k D的酶带活性达到峰值 ;另外在尾退化的高峰期还检测到了 7条新酶带 ,其中 5 5 k D的酶带活性也达到峰值。以上结果提示 。

酿造激活剂对不同曲霉菌株蛋白酶组分及活性的影响

以活性电泳比较了不同来源酱油生产菌株的蛋白酶组分,研究了激活对蛋白酶组分表达及活性的影响。结果表明,不同来源菌株蛋白酶组分数量各不相同,其中米曲霉GM蛋白酶组分数量最多,其他菌株的蛋白酶组分均少于米曲霉GM。激活后多数蛋白酶组分的活性都有提高,其中对GM的组分4、AS3.324的组分4、336-2的组分1、3042-HL的组分4、3042-ZH的组分4和3.042KG的组分7激活作用明显。激活剂还能诱导336-2新的蛋白酶组分表达。

酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的原核表达及活性检测

目的:克隆酮古龙酸菌Y25的山梨醇脱氢酶基因sldh,在大肠杆菌中进行表达并检测表达产物的活性。方法:以酮古龙酸菌Y25基因组DNA为模板,PCR扩增sldh基因,连接到表达载体pTIG,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;取表达菌体、菌体裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE分析;以山梨醇为底物,通过活性电泳、体外转化及休止细胞转化进行sldh基因表达产物的活性检测。结果:扩增得到1740 bp的山梨醇脱氢酶基因,构建了表达质粒pTIG-sldh并在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示表达产物为可溶性形式,相对分子质量约58×103;活性电泳结果说明表达产物在以山梨醇为底物时表现出脱氢酶活性,而经体外转化和休止细胞转化后薄层层析检测出转化产物山梨糖的存在。结论:在大肠杆菌中实现了酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的可溶性表达,且表达的重组脱氢酶能将山梨醇脱氢生成山梨糖。

小白鼠发育过程中小肠蛋白酶活性变化的研究

用活性电泳方法对小鼠发育过程中小肠蛋白酶的活性进行了研究。结果发现：（１）出生前，Ｅ１３～Ｅ１７小肠中未检测到蛋白酶活性。Ｅ１９小肠有一个分子量４３ｋＤ的蛋白酶，该酶在中性和碱性条件下均有活性。（２）出生后，小肠中蛋白酶活性迅速增加。而且与酸性条件相比，在中性和碱性条件下，蛋白酶的种类多，活性高。（３）食物的种类对小肠蛋白酶活性有显著影响。

大鼠再生肝酪氨酸碱性磷酸酶活性变化及功能研究

运用活性电泳技术对ＳＤ大鼠肝再生进程中酪氨酸碱性磷酸酶的活性进行了追踪检测，用统计学方法分析了各再生时期肝组织中单核、双核及多核肝主质细胞出现频率的变化动态，并进一步研究了酪氨酸碱性磷酸酶活性与细胞分裂的关系。结果表明：（１）单核细胞出现频率与双核细胞出现频率呈强负相关性。（２）酪氨酸碱性磷酸酶在肝再生过程中起促进胞质分裂的作用。

酮古龙酸菌山梨酮脱氢酶的原核表达及活性鉴定

目的:克隆酮古龙酸菌Y25的山梨酮脱氢酶基因sndh2,在大肠杆菌中进行表达,并检测表达产物的活性。方法:以酮古龙酸菌Y25基因组DNA为模板,PCR扩增sndh2基因,连接到pET22b表达载体后转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达;对菌体裂解液进行SDS-PAGE分析;以D-木糖为底物,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后活性染色及DCIP检测法鉴定表达产物的脱氢酶活性。结果:扩增得到1290 bp的山梨酮脱氢酶基因;构建了表达质粒pET22b-sndh2,SDS-PAGE结果显示获得相对分子质量为43.1×103的可溶性表达产物;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上出现的蓝黑色条带及DCIP检测液颜色的变化说明表达产物在以D-木糖为底物时表现出脱氢酶活性。结论:在大肠杆菌中表达的山梨酮脱氢酶具有生物活性。

山梨醇脱氢酶的克隆、表达及活性检测

目的:从氧化葡糖杆菌H24中克隆山梨醇脱氢酶基因进行表达并检测其活性。方法:以氧化葡糖杆菌H24基因组DNA为模板,PCR扩增包括启动子、结构基因及其后的终止序列在内的山梨醇脱氢酶基因;将PCR产物插入pMD18T载体,转化大肠杆菌DH5α;通过活性电泳检测山梨醇脱氢酶在大肠杆菌中的表达及活性。结果:从氧化葡糖杆菌H24中扩增得到山梨醇脱氢酶基因并在大肠杆菌中实现表达,重组菌株经活性电泳检测具有醇糖转化活性。结论:原核表达的山梨醇脱氢酶具有很强的醇糖转化活性。

基于光密度法的蛋白酶电泳定量评价胃蛋白酶的功效

目的以胃蛋白酶原料为研究对象,通过光密度定量蛋白酶谱法分析胃蛋白酶的功效。方法以Native-PAGE负染电泳以及光密度数据分析技术为依托,进行方法学验证,利用该方法对胃蛋白酶进行分析研究,对产品质量及功效直观评价。结果建立了可以直观表征及定量比较酶功效的电泳技术,通过光密度数据提取对4种胃蛋白酶原料功效进行比较,与传统效价测定方法比较,结果更加精确,能够直观反映酶制剂的比酶活信息。结论该法测定结果反映了实际活性成分,能够更加直接反映胃蛋白酶的功效及质量,具有较好的应用前景,该方法亦可应用在其他酶制剂的分析研究中。

大鲵（Andrias davidianus）4种生殖器官的蛋白水解酶种类和活性分析

用蛋白水解酶活性电泳方法（G-PAGE）分析了大鲵卵巢，输卵管，精巢，输精管的蛋白水解酶种类和活性，结果表明：1）精巢和输精管的蛋白水解酶种类（分子量）相似，活性有差异。主要的蛋白水解酶分子量为240，85，73，61，51，42，37和23kD；2）输精管的蛋白水解酶在碱性条件下活性最强，在中性条件下活性次之，在酸性条件下活性最弱。精巢的蛋白水解酶在中性和碱性条件下活性相似，在酸性条件下活性很弱，推测精巢蛋白水解酶活性的最适pH为中性，输精管蛋白水解酶活性的最适pH为碱性；3）卵巢和输卵管的蛋白水解酶种类（分子量）相似，主要的蛋白水解酶分子量为73、61、51和37kD，它们在酸性条件下活性最强，在中性条件下几乎无活性，推测它们活性的最适pH为酸性；4）与卵巢和输卵管相比，精巢和输精管的蛋白水解酶种类多，活性强，活性的最适pH高，推测这种差别可能有利于受精和发育中所需的蛋白水解酶快速灭活或活化。

微生物油脂卷枝毛霉中苹果酸酶异构体的解析

卷枝毛霉(Mucor circinelloides)是一种能够富集γ-亚麻酸的产油真菌,而其中含有的苹果酸酶被认为是该真菌中生物合成多不饱和脂肪酸所需要的重要的酶。采用活性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对卷枝毛霉中的苹果酸酶异构体进行纯化研究,发现其中有至少6种异构体。从不同培养基中分离提取异构体3和4,经过纯化,在SDS-PAGE电泳中分离出一条单一的谱带,用胰蛋白酶消化带胶蛋白,进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析。结果表明:异构体3和4的相对分子质量非常接近,分别是87.339 kDa和86.503 kDa。

荷斯坦奶牛瘤胃微生物脲酶的分离与鉴定

本研究旨在从荷斯坦奶牛瘤胃中分离活性脲酶。从奶牛瘤胃中收集瘤胃内容物,通过离心和超声破碎的方法得到不含菌体细胞的瘤胃液(CFRF)和瘤胃菌体蛋白液(RCP),利用85%硫酸铵盐析,并透析后,用HiTrap Capto Q离子交换层析柱纯化脲酶。将纯化后的脲酶用活性PAGE分离,并利用改良的Fishbein染色法,确定脲酶条带位置,切胶,经胰蛋白酶消化后,用LC-MS/MS分析,并用SEQUEST软件在NCBI数据库搜索与质谱信号相匹配的肽段和蛋白质。结果表明从CFRF和RCP中分离出较高活性的脲酶,但经染色后只有RCP脲酶显示活性条带。经质谱分析,最终鉴定出了3种微生物来源脲酶,分别与嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)和嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)相似。这说明绕过纯培养微生物,直接从瘤胃中分离脲酶,来研究其性质和来源是可行的,尤其适合对未培养微生物的研究。

猕猴生殖、泌尿、免疫系统各器官蛋白水解酶种类和性质

为了系统研究太行山猕猴（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔａｔｃｈｅｌｉｅｎｓｉｓ）生殖、泌尿、免疫系统各器官蛋白水解酶的种类和性质，用活性单向电泳（１Ｄ－Ｇ－ＰＡＧＥ）和活性双向电泳（２Ｄ－Ｇ－ＰＡＧＥ）方法研究了太行山猕猴生殖系统、泌尿系统和免疫系统中蛋白水解酶种类和酶活性的ｐＨ依赖性。结果表明：（１）同一系统功能相近的器官之间蛋白水解酶非常相似，不同系统的器官之间，中性和碱性蛋白水解酶种类有很大差异；（２）同一器官的酸性蛋白水解酶种类与它的中性和碱性蛋白水解酶种类迥异，而且３个系统中各器官均具有３１、３０和２９ｋＤ３种酸性蛋白水解酶，但它们在不同器官中的活性有较大差异；（３）用２Ｄ－Ｇ－ＰＡＧＥ测得在ｐＨ７．０条件下。