CREB激活促进神经痛大鼠脊髓背角HCN4转录的实验研究

目的探讨CREB激活促进神经痛大鼠脊髓背角HCN4转录的信号机制。方法雄性成年SD大鼠随机分为6组:Sham组,Sham+Vehicle组,CCI+Vehicle组,CCI+H-89(PKA抑制剂),CCI+KN-93(CaMKⅡ抑制剂),CCI+Naphthol AS-E(CREB抑制剂)。各组大鼠在CCI术后分别注射0.005%DMSO、H-89、KN-93或Naphthol AS-E,在CCI术前,术后1、3、5、7 d检测各组大鼠给药1 h后的机械刺激缩足反射阈值(MWT);实时荧光定量PCR检测HCN4 mRNA表达;Western blot检测脊髓(L_(4)~L_(6))背角HCN4、PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB表达;EMSA检测CREB与HCN4启动子的DNA结合活性。结果与Sham组相比,CCI+Vehicle组在1、3、5、7 d的MWT显著降低(P<0.05),脊髓背角HCN4 mRNA表达明显上调(P<0.05),HCN4、PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB蛋白表达明显上调(P<0.05);与CCI+Vehicle组相比,H-89、KN-93或Naphthol AS-E抑制剂组MWT显著上调(P<0.05),HCN4、PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB蛋白表达显著下降(P<0.05),HCN4 mRNA表达显著减少(P<0.05);与Sham组相比,CCI+Vehicle组背角CREB与HCN4启动子的DNA结合活性升高,但H-89、KN-93或Naphthol AS-E处理后CREB与HCN4启动子的DNA结合活性减弱。结论神经痛大鼠脊髓背角PKA和CaMKII激活,导致转录因子CREB与HCN4基因启动子结合,促进HCN4转录和蛋白表达。

一种快速鉴定Femu2p-C_2H_2蛋白与TTGGGTBOX相互作用的EMSA实验法

分析了电泳迁移率(EMSA)技术研究进展及其优缺点,并在此基础上进行实验方法改进。通过检测TTGGGT Box及其突变体与Femu2p-C2H2蛋白的相互作用,探索并总结出一套快速、简便、经济适用的EMSA实验法,该方法可用于DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的特异性竞争反应分析。

己酮可可碱具有抗大鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用

目的探讨己酮可可碱(PTX)对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝脏的抗炎作用。方法SD大鼠40只,标准饲料喂养1周后,随机分为4组:对照组、12周模型组、16周模型组和PTX治疗组。用高脂饮食法建立非酒精性脂肪性肝炎模型,16周末处死全部大鼠,收集血浆和肝组织,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度,放射免疫法(RI)检测血浆白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)的浓度,采用免疫组织化学观察肝脏白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)的表达,采用电泳迁移率实验(EMSA)检测肝组织核转录因子-κB(NF-κB)的活性变化,RT-PCR方法检测肝脏TNF-αmRNA的转录。结果模型组血浆TNF-α,IL-1β,IL-6均较正常组有所升高,而治疗组较模型组有所降低。免疫组织化学实验结果表明:与对照组相比,12周,16周模型组及PTX治疗组肝脏IL-1β,IL-6的表达显著增加(P<0.05),与12周模型组相比,PTX治疗组IL-1β,IL-6的表达有所降低(P<0.05)。与16周模型组相比,PTX治疗组IL-6的表达有所降低(P<0.05)。EMSA结果显示:与对照组相比,模型组NF-κB的活性逐渐增高,经治疗后,PTX治疗组NF-κB的活性有所减低。PT-PCR检测结果显示,与对照组相比,16周模型组TNF-αmRNA的表达有显著的升高(P<0.05)。与16周模型组相比,PTX治疗组TNF-αmRNA的表达有显著的降低(P<0.05)。结论PTX对NASH具有一定的抗炎作用。

氯胺酮对离体人辅助T细胞分化的影响

目的:探讨氯胺酮对离体人辅助性T(Th)细胞分化和细胞内转录因子T-bet及GATA3活性的影响。方法:10例男性健康志愿者(20～45岁,BMI 15～25 kg/m2),分别采集空腹时外周静脉血20 ml,分离外周血单核细胞(PBMCs)。每份血样的PBMCs均随机加入佛波醇-十四酸酯-乙酸酯(PMA)25 ng/ml和离子霉素1μg/ml以及各种浓度(0、50、100、200μmol/L)的氯胺酮孵育4 h。然后测量Th细胞亚群百分数、上清液中的干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)的水平以及细胞内转录因子T-bet和GATA3的DNA结合活性。结果:在PMA和离子霉素刺激下Th1和Th2细胞计数、IFN-γ和IL-4水平均显著增加;在PMA和离子霉素刺激下,氯胺酮剂量依赖性降低Th1和Th2细胞计数、IFN-γ和IL-4水平,而增加Th1、Th2细胞计数的比值(Th1/Th2)和IFN-γ、IL-4的比值(IFN-γ/IL-4);同样经刺激后,细胞内T-bet和GATA3的活性显著增加;氯胺酮剂量依赖性降低T-bet和GATA3的活性,而增加T-bet与GATA3活性的比值(T-bet/GATA3)。结论:在PMA和离子霉素的刺激下,氯胺酮能够抑制Th细胞的分化,从而抑制各细胞因子的分泌,但Th1/Th2增加;氯胺酮增加Th1/Th2可能与调节增加T-bet/GATA3有关。

NF-κB参与枸橼酸铁铵过载诱导的人肝细胞hepcidin基因表达

目的:研究核因子κB(NF-κB)在枸橼酸铁铵过载诱导人肝细胞铁调素(hepcidin)基因表达中的调控作用。方法:依据前期不同浓度枸橼酸铁铵抑制人肝细胞HH4增殖实验结果,选取0.1、1、5和10 mmol/L枸橼酸铁铵处理人肝细胞HH4 48 h,半定量PCR法检测胞内hepcidin的表达水平;利用染色质免疫共沉淀(Ch IP)、电泳迁移率实验(EMSA)和双萤光素酶报告基因检测系统,并结合胞内NF-κB活性抑制实验,确定NF-κB对人hepcidin转录活性的影响。结果:5 mmol/L和10 mmol/L浓度的枸橼酸铁铵处理细胞后,hepcidin表达水平显著增强;Ch IP和EMSA实验证实NF-κB能够与hepcidin基因启动子结合;重组萤光素酶报告质粒TOPFlash-p Hepcidin相对萤光素酶活性明显高于对照组;与重组质粒TOPFlash-p Hepcidin相比,突变重组萤光素酶报告质粒TOPFlash-p Hepcidin-mut相对萤光素酶活性显著降低;NF-κB抑制剂BAY 11-7082显著降低了hepcidin基因的表达。结论:NF-κB参与了铁过载诱导的人hepcidin基因表达。这为进一步深入研究肝细胞铁过载模式下多因子协同调控hepcidin基因表达的具体分子机理奠定了基础。

玉米转录因子zmCBF1的凝胶阻滞分析

凝胶阻滞试验是分析核酸与蛋白质相互作用的有效方法,在转录因子的功能分析中得到了广泛应用。以玉米转录因子zmCBF1与顺式元件CRT的结合为例,建立了用于转录因子分析的GRA/EMSA实验体系,并对其在应用中可能出现的问题进行了分析。

转录因子Ets-1与β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因启动子结合活性分析(英文)

β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-2,-8(β3GnT-2,β3GnT-8)共同参与多聚N-乙酰氨基乳糖([Galβ1→4GlcNAcβ1→3]n)的合成,从而使得细胞表面的相应糖链结构延长进而影响细胞的恶性转化.已有研究表明,在全反式维甲酸诱导人白血病细胞株HL-60分化过程中β3GnT-2,-8的表达上调,但其分子机制不明.本文旨在探讨ATRA诱导HL-60分化过程中,转录因子Ets-1对β3GnT-2,-8表达调控的分子机制.采用10-6mol/L ATRA诱导人白血病细胞株HL-60向粒系分化,RT-PCR检测到细胞中Ets-1的表达明显增加;进一步采用染色质免疫沉淀(ChIP)结合电泳迁移率变动实验(EMSA)检测证实,有活化的Ets-1结合至β3GnT-2/-8基因调控区.以上结果表明,转录因子Ets-1对人白血病细胞株HL-60分化过程中β3GnT-2,-8基因有表达调控作用.

青春期大鼠接触雌激素下调乳腺癌中NF-κBP65表达

为观察青春期大鼠接触雌激素如辛基酚(OP)或三羟异黄酮对乳腺癌中NF-κB的影响,通过免疫组织化学、RT-PCR、Western blotting和电泳迁移率改变实验(EMSA)等方法观察雌激素影响大鼠乳腺癌中NF-κB P65的改变.结果表明NF-κB P65在细胞胞浆和胞核中均有表达,在乳腺癌组织中以胞核表达多见.与模型组(mod)比较,给予40 mg/kg辛基酚(OP40)或500 mg/kg三羟异黄酮(GEN)处理的大鼠乳腺癌中NF-κB P65 mRNA表达明显降低,且细胞核中NF-κB P65蛋白表达也明显减少,NF-κB DNA结合活性明显降低.OP及GEN降低大鼠乳腺癌发病可能与减少NF-κB P65核转位、降低NF-κB的DNA结合活性有关.

HIF-1α调控Snail基因启动子活性及作用位点的鉴定

[目的]探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对Snail启动子活性的作用,并鉴定其作用位点。[方法]应用transfac软件分析Snail启动子区域潜在的HIF-1α结合位点。通过荧光素酶报告基因载体、电泳迁移率实验(EMSA)和染色质免疫沉淀(Ch IP)实验研究HIF-1α是否能够与Snail启动子区域潜在的位点结合,直接调控Snail的表达。[结果]生物信息学分析发现Snail启动子区域存在2个HIF-1α可能的结合位点(-653,-649)和(-543,-538)。双荧光素酶报告基因检测发现(-543,-538)位点是HIF-1α特异性结合于Snail的位点,HIF-1α蛋白与之结合后调节Snail基因转录活性。EMSA和Ch IP实验证实了HIF-1α蛋白和Snail启动子区(-543,-538)结合,直接上调Snail的表达。[结论]Snail启动子区域存在HIF-1α的结合位点,HIF-1α与之结合后直接调控Snail的表达。