产黄青霉简单高效遗传转化法——电激转化法

目的研究产黄青霉(P.chrysogenum)电激转化方法,建立产黄青霉快速、高效的遗传转化方法。方法应用美国Bio-Rad电转仪,将外源DNA转化入产黄青霉菌丝中,研究了菌丝培养时间、电场强度、DNA类型等对遗传转化的影响。结果菌丝培养24h,处于旺盛生长阶段,电场强度为6000V/cm,电阻200Ω,电容20μF,环状质粒DNA较线状能获得转化效率稍高,1μg DNA获得的克隆数可达500个。结论应用电激转化方法对产黄青霉进行遗传转化属首次报道,特别是可直接将目的片段与T-DNA相融合,转化入产黄青霉中,该方法操作简单,快速高效。

水稻幼胚电激转化及转基因植株再生(英文)

幼胚的遗传转化对研究植物胚胎发育相关基因的表达与调控具有重要意义 ,也为植物遗传改良提供新的技术。本研究借助一种自制的特殊装置 ,采用电激法将GFP基因转入 2 - 3天水稻幼胚 ,得到瞬时表达 ,4- 6天水稻幼胚经电激后再生了植株 ,并在愈伤组织阶段及R0植株中检测到GFP荧光的转基因植株 ,从而建立了水稻幼胚的遗传转化实验系统。在电容为 5 0 0 μF、电压为 30 0V/cm ,浓度为 10 0 μg/mL的条件下 ,幼胚GFP的电激转化频率可达 35 %。在pH 5 .8的电激缓冲液中 ,最高转化频率可达 40 %。在三种不同的启动子实验中 ,以Ubi启动子的转化频率最高。

一种适合于少量幼胚材料的电激转化方法

设计制作了一种适合于对少量植物细胞材料进行电激转化的装置。用该装置对小麦受精后 4～ 7d的幼胚进行电激转化获得成功。当电容为 2 0 μF、电场强度为5 0 0V·cm- 1 时 ,由Act1启动子驱动的GUS基因的瞬时表达频率为 34 .2 %,而CaMV 35S启动子控制的GFP基因的瞬时表达频率为 7.9%。

盐生杜氏藻RNAi应用中的电激转化条件

采用了两种电激模式-高电场强度低电容模式下3～7kV／cm和低电场强度高电容模式下300-500V／cm转化质粒pBl221-cat；PCR扩增检测cat基因部分序列及组织化学染色法GUS检测也同时证明质粒pBl221-cat在盐生杜氏藻中瞬时表达。在此基础之上，插入pds基因的正反向重复序列，构建RNAi表达载体pBIRNAI-Dsa，电激方法转入杜氏盐藻细胞，荧光定量PCR结果表明，转入干涉载体pBIRNAI-Dsa的实验组的pds基因表达显著下降，最低达对照组的28％，表明表达受到抑制。

电激转化GFP基因在小麦合子和早期原胚中的高频表达(英文)

用电激法将GFP基因成功转入分离的小麦 (TriticumaestivumL .)合子及早期原胚中。在电场强度 15 0V/cm、电容 2 5 μF、线性DNA浓度 2 0 0 μg/mL、电激缓冲液pH 7.2的条件下 ,得到GFP基因在早期原胚中的高频瞬间表达 (46 .7% )。与开花后 5d胚胎的最适电场强度相比 ,合子和早期原胚因较幼嫩而最适电场强度较低。电激后的一些早期原胚可以在KM8p培养基中培养并继续分裂 ,分裂后的细胞中也能观察到GFP基因的表达。此外 ,电激后的合子及 2细胞、4细胞和

绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌电激转化的研究

随着致病菌的变迁,绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌所致的严重感染,已成为危害人民健康的重要疾病,尤其是临床大量耐药菌珠的涌现,已引起临床微生物学和传染病学界的高度重视。为研究细菌的耐药机理,关键的技术步骤之一是将编码耐药相关基因的重组质粒导入宿主菌。绿脓杆菌和金葡菌作为外源基因的受体菌,由于自身的结构特点,使用常规的氯化钙等化学方法进行转化实验有极大困难。本研究采用国产基因脉冲导入仪(LN201型,天津理工学院研制)应用电激方法,进行绿脓杆菌转化的可行性实验,探索最佳电激条件,并对金黄色葡萄球菌的电激转化进行了初步分析。

紫菜苔花粉原生质体的电激转化及Zm13-260-GUS-NOS融合基因的时序表达

利用花粉作为外源基因的媒介进行植物遗传转化是一个活跃的研究方向,而将外源基因导入花粉是这一转化体系的重要环节.但因花粉壁厚,导入外源DNA比较困难,而脱壁后的花粉原生质体则理应相对优越.近年花粉原生质体的分离与培养已取得了一定进展,以花粉原生质体作为转化受体已成为可能.为此,我们以花粉特异启动子Zm13-260控制的GUS基因作为报告基因,用电激法分别转化紫菜苔花粉原生质体和花粉粒,通过瞬间表达检测,比较了二者的转化效果,并探讨了GUS基因在不同发育时期花粉原生质体中的时序表达特性.

植物幼小原胚的电激转化

用电激法将外源报告基因导入植物原胚获得瞬间表达．用酶解和显微解剖法分离出烟草含８～３２个细胞的幼小原胚与含２５０～４００个细胞的球形胚，导入ＧＵＳ和ＧＦＰ基因后，置于ＫＭ８ｐ培养基 １～２ｄ．当电场强度为 ５００～１５００ Ｖ／ｃｍ时，可检测到 ＧＵＳ蓝色反应和 ＧＦＰ绿色荧光，其中幼小原胚在电场强度为 ７５０ Ｖ／ｃｍ时，外源基因瞬间表达频率最高，为 ２．２％，球形胚在电场强度为１２５０ Ｖ／Ｃｍ时表达频率最高为 ５．９％．若以转化细胞占胚细胞总数的比例为有效转化频率，则幼小原胚的有效转化频率约为球形胚的７倍．

利用电激共转化法转化橡胶树悬浮细胞的初步研究

利用电激转化法对橡胶树悬浮细胞系进行转化,初步确定卡那霉素的筛选浓度、共转化的实验条件。通过电激共转化法将NPTII、GUS、EGFP和Hb CBF1基因成功导入到橡胶树悬浮细胞并整合到基因组中。通过卡那霉素抗性筛选、GFP荧光观察和PCR验证等方法,确定外源DNA片段转化成功。共筛选得到95个抗性愈伤组织,其中9个愈伤组织经过PCR验证确定整合有外源DNA片段,1个愈伤组织共转化有NPTII和GUS基因。此结果表明电激共转化法可成功应用于橡胶树悬浮细胞转化操作。

一株德国酿酒酵母无抗性电转化条件的研究

无抗性基因转化是实现转基因食品安全性的重要途径之一,转化子筛选是该技术面对的最大瓶颈。本研究以一株德国酿酒酵母NSLA112为材料,探讨了电激转化过程中各参数对该细胞存活率的影响。结果表明:①该酵母与国内常见酿酒酵母有较大差别,电激转化参数需要随不同酵母种类进行调整;②无筛选标记的转化方法要求细胞具有较高的转化效率,同时降低转化操作后细胞的存活数量,以提高筛选工作的效率,较好地平衡了细胞死亡率与转化效率的关系。

巴西橡胶树游离小孢子培养

以橡胶树品种海垦2号为材料,对橡胶树游离小孢子培养体系进行初步研究,为进一步建立其成熟培养体系提供基础。小孢子的提取采用直接研磨法和间接研磨法进行,结果发现以间接研磨法为佳,虽然工作量大,但污染率低、杂质少、培养效果好。对小孢子分别进行高温热击、Starvation Medium B溶液、对照预处理试验,发现用Starvation Medium B溶液预处理小孢子2 d有利于小孢子分化。不同的碳源比较发现麦芽糖培养效果较蔗糖好。对诱导培养基的组分、pH研究发现,以改良N6为基本培养基添加外源激素2,4-D 0.5 gm/L、KT 0.5 mg/L,pH 6.6时诱导效果好,小孢子分化率达8.33%。小孢子的分化以B途径为主,初步获得小孢子分化的细胞团和微愈伤。同时以橡胶树小孢子为受体进行电激转化试验,瞬时表达结果证明外源基因已导入部分小孢子基因组中。

LZ-8基因的克隆及其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达

用 PCR 从灵芝(Gamoderma lucidum)基因组扩增免疫蛋白 LZ-8基因,将其构建到酵母表达质粒 pPICZaA 中,采用电激转化法转化毕赤酵母,获得转化子。对其 Sourthern 杂交分析,结果表明 LZ-8基因整合到毕赤酵母基因组。对转化酵母作发酵培养,SDS—聚炳烯酰胺凝胶电泳检测到 LZ-8蛋白的表达。

生物固氮

961070 腐生性固氮放射形土壤杆菌5D-1的遗传转化[俄]/Yablunenko,A.N.…//Genetika(Mascow).-1995,31(6).-778～783[译自DBA,1995,14(19),95-11503] 用质粒pVZ2361和染色体DNA(含有标记trp+、his+和卡那霉素抗性)转化腐生性固氮放射形土壤杆菌5D-1的转化率分别为10000/μg

轮状病毒VP4-ST融合基因转化小球藻的筛选

进行了椭圆小球藻对G418和卡那霉素的抗生素敏感性试验,同时采用电激转化法将构建好的含35S启动子的重组植物表达载体pBin-VP4-ST转化椭圆小球藻,并对转基因小球藻进行了PCR和PCR-Southern-blot检测。结果显示,30mg/L的G418为转化子的最佳抗生素筛选浓度。PCR和PCR-South-ern-blot检测结果显示,VP4-ST已成功插入到转基因小球藻基因组中,从而为用转基因小球藻作为生物反应器生产抗腹泻口服疫苗奠定了基础。