目的:研究Fe^(3+)和Cys对CHO细胞表达免疫球蛋白G(IgG)电荷异构体比例的影响。方法:在补料分批培养外泌表达IgG的CHO细胞株中,以不同的策略单独或联合添加不同浓度的Fe^(3+)或Cys;培养14 d后离心得上清液,通过生化分析仪测定上清液中Ig...目的:研究Fe^(3+)和Cys对CHO细胞表达免疫球蛋白G(IgG)电荷异构体比例的影响。方法:在补料分批培养外泌表达IgG的CHO细胞株中,以不同的策略单独或联合添加不同浓度的Fe^(3+)或Cys;培养14 d后离心得上清液,通过生化分析仪测定上清液中IgG的含量,利用Protein A MagBeads亲和纯化该抗体,通过糖基化修饰、阳离子亲和层析(CEX)、非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(nrCE-SDS)、硼酸亲和层析(BAC)及疏水相互作用色谱(HIC)进行鉴定。结果:Fe^(3+)的添加可提高IgG酸性异构体比例,并且Cys可增强Fe^(3+)的提升效果,仅添加Cys对酸性异构体的比例没有影响;电荷异构体表征表明酸性异构体含量提高主要源于唾液酸修饰、片段、Fc段氨基酸位点氧化修饰以及糖化水平的增加。结论:Fe^(3+)与Cys通过提高唾液酸修饰、片段的丰度、糖化水平以及某些氨基酸位点的氧化,导致IgG酸性异构体比例显著增加。展开更多
目的针对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的关键质量参数进行检测方法研究。方法采用基质辅助激光解吸/飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)及尺寸排阻色谱与多角度光散...目的针对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的关键质量参数进行检测方法研究。方法采用基质辅助激光解吸/飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)及尺寸排阻色谱与多角度光散射联用(size exclusion chromatography with multi-angle light scattering,SEC-MALS)法测定相对分子质量及其分布;采用毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)和分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SE-HPLC)分析纯度;采用离子交换法和毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)分离分析电荷异构体;采用“双”酶切肽图法进行一级结构鉴别试验和序列覆盖率分析。结果MALDI-TOF MS测得相对分子质量45.01×10^(3);SEC-MALS得到其单体相对分子质量为45.17×10^(3)(±0.226%);两种相对分子质量测定方法结果一致。CE-SDS(非还原)纯度为98.77%,其他成分1.23%;SE-HPLC纯度为98.07%,其他成分1.93%;两种纯度测定方法结果一致。强阳离子交换共鉴定到14种电荷异构体组分,其中酸性峰占比52.08%,主峰占比26.22%,碱性峰占比21.70%;CZE鉴定到8种电荷异构体组分,其中酸性峰占比52.10%,主峰占比25.27%,碱性峰占比22.63%;两种电荷异构体鉴别方法,酸性组分、主峰与碱性组分,分布规律一致。“双”酶切肽图法实现重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的序列100%覆盖,实测序列与预期序列一致。结论建立了重组Ⅲ型人源化胶原蛋白关键质量参数分析方法,该方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,为我国重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的质量控制提供了参考依据。展开更多
文摘目的:研究Fe^(3+)和Cys对CHO细胞表达免疫球蛋白G(IgG)电荷异构体比例的影响。方法:在补料分批培养外泌表达IgG的CHO细胞株中,以不同的策略单独或联合添加不同浓度的Fe^(3+)或Cys;培养14 d后离心得上清液,通过生化分析仪测定上清液中IgG的含量,利用Protein A MagBeads亲和纯化该抗体,通过糖基化修饰、阳离子亲和层析(CEX)、非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(nrCE-SDS)、硼酸亲和层析(BAC)及疏水相互作用色谱(HIC)进行鉴定。结果:Fe^(3+)的添加可提高IgG酸性异构体比例,并且Cys可增强Fe^(3+)的提升效果,仅添加Cys对酸性异构体的比例没有影响;电荷异构体表征表明酸性异构体含量提高主要源于唾液酸修饰、片段、Fc段氨基酸位点氧化修饰以及糖化水平的增加。结论:Fe^(3+)与Cys通过提高唾液酸修饰、片段的丰度、糖化水平以及某些氨基酸位点的氧化,导致IgG酸性异构体比例显著增加。
文摘目的针对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的关键质量参数进行检测方法研究。方法采用基质辅助激光解吸/飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)及尺寸排阻色谱与多角度光散射联用(size exclusion chromatography with multi-angle light scattering,SEC-MALS)法测定相对分子质量及其分布;采用毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)和分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SE-HPLC)分析纯度;采用离子交换法和毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)分离分析电荷异构体;采用“双”酶切肽图法进行一级结构鉴别试验和序列覆盖率分析。结果MALDI-TOF MS测得相对分子质量45.01×10^(3);SEC-MALS得到其单体相对分子质量为45.17×10^(3)(±0.226%);两种相对分子质量测定方法结果一致。CE-SDS(非还原)纯度为98.77%,其他成分1.23%;SE-HPLC纯度为98.07%,其他成分1.93%;两种纯度测定方法结果一致。强阳离子交换共鉴定到14种电荷异构体组分,其中酸性峰占比52.08%,主峰占比26.22%,碱性峰占比21.70%;CZE鉴定到8种电荷异构体组分,其中酸性峰占比52.10%,主峰占比25.27%,碱性峰占比22.63%;两种电荷异构体鉴别方法,酸性组分、主峰与碱性组分,分布规律一致。“双”酶切肽图法实现重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的序列100%覆盖,实测序列与预期序列一致。结论建立了重组Ⅲ型人源化胶原蛋白关键质量参数分析方法,该方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,为我国重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的质量控制提供了参考依据。
