海洋球石藻病毒甾醇去饱和酶基因的克隆与表达

以海洋球石藻(Emiliania huxleyi)病毒EhV-99B1基因组为模板,用一对病毒甾醇去饱和酶(sterol desaturase,SD)基因的特异性引物进行PCR扩增,获得EhV-SD基因,将扩增产物克隆至pMD19-T载体后进行测序,并对该基因编码的蛋白质序列进行生物信息学分析。将测序正确的目的基因亚克隆入酿酒酵母表达载体pYES2/CT中,转化酿酒酵母缺陷型菌株YMR015C,并用 D-半乳糖诱导表达,提取重组酵母和野生型酵母细胞总脂并进行薄层色谱(thin layer chromatography,TLC)分析。结果显示:EhV-SD基因全长为987 bp,编码328个氨基酸,该蛋白质的理论等电点为8.31,预测的蛋白质分子质量为37.83 ku,为疏水性、不稳定蛋白质,存在6个跨膜结构域,不存在信号肽;其二级结构中,α-螺旋含量最多。氨基酸序列比对结果显示,EhV-SD基因与宿主球石藻及金色藻属( Chrysochromulina sp.CCMP 291)亲缘关系较近。TLC结果表明,EhV-SD基因的表达导致酵母细胞极性较强的脂类明显减少,而极性较弱的脂质成分显著增加,表明EhV-SD具有一定的催化活性。

基于脂质组学的海洋颗石藻病毒甾醇去饱和酶及脂肪酸去饱和酶基因功能分析

赫氏颗石藻(Emiliania huxleyi)宿主-病毒(E.huxleyi virus,EhV)的互作过程是影响海洋碳、硫生物地球化学循环及气候变化的重要环节。在共进化过程中,Eh V通过基因水平转移从宿主基因组中“劫获”了一组鞘脂从头合成相关酶基因,重构宿主脂代谢网络以支持病毒的特殊需求。目前,对病毒这组相关酶基因的生物学功能尚不十分清楚。以颗石藻病毒Eh V-99B1基因组中的甾醇去饱和酶(EhV-SD)和脂肪酸去饱和酶(Eh V-FAD)基因为研究对象,构建酿酒酵母重组表达载体p YES2/CT-SD和p YES2/CT-FAD,转化相应的基因缺陷型酵母菌株YMR015C和YGL055W获得重组酵母细胞株,进一步采用UPLC-Q-Exactive-MS非靶向脂质组学技术,比较分析重组酵母和缺陷型酵母细胞脂质的组成和含量变化。结果显示,Eh V-SD与Eh V-FAD基因在酿酒酵母中成功表达并具有生物学活性。Eh V-SD过表达显著改变了重组酵母细胞脂质代谢,含多不饱和酰基链的磷脂酰胆碱(PC,20︰4/20︰5/20︰6)和甘油三酯(TAG,12︰3)种类的丰度显著升高;而部分多不饱和脂肪酸(FA,16︰2/16︰4)和含多不饱和酰基链的磷脂酰甘油(PG,16︰2/18︰4)丰度则显著降低。Eh V-FAD过表达显著增加了重组酵母中单不饱和脂肪酸的生物合成,特别是棕榈油酸(C16︰1)和油酸(C18︰1)显著积累,而饱和脂肪酸的含量则显著降低,表明Eh V-FAD与酵母Δ9FAD具有类似的生物学功能。海洋病毒中脂质代谢相关新基因功能的确定,有助于从代谢角度深入认识海洋病毒-宿主的互作关系,也为相关功能基因在生物技术领域的应用提供科学依据。

甾醇C-22去饱和酶高表达对酵母细胞麦角甾醇合成的影响

通过PCR扩增克隆到酵母菌甾醇C-22去饱和酶基因(ERG5)的编码序列及其终止子序列,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体,以磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子为上游调控元件构建了酵母菌表达质粒pYPE5。以铜离子螯合蛋白基因CUP1替换ERG5基因内部序列获得ERG5破坏菌株YSE5,其中麦角甾醇的合成被阻断,而积累了甾醇中间体Ergosta-5,7-dien-3β-ol。表达质粒pYPE5转化破坏菌株后使细胞恢复了合成麦角甾醇的能力。说明表达质粒上的ERG5基因得到了功能性的表达。将表达质粒pYPE5转化酿酒酵母单倍体菌株YS58,通过营养缺陷互补筛选到重组菌株YS58(pYPE5)。对重组菌株、破坏菌株和互补菌株细胞甾醇组分和含量进行测定,发现重组菌株和互补菌株的麦角甾醇和总甾醇含量明显低于对照菌YS58(YEp352)。测定不同培养时间细胞的麦角甾醇含量,发现重组菌株的麦角甾醇含量始终低于对照菌YS58(YEp352)。可见,ERG5在酵母中的高表达导致细胞麦角甾醇含量降低。