环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒

【目的】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究拟用该技术建立菊花中番茄不孕病毒(TAV)的检测方法。【方法】设计能识别TAV CP序列6个特定区域的4种LAMP特异引物,对MgCl2、dNTPs、甜菜碱等LAMP反应条件进行优化,利用新建的LAMP法检测TAV,比较LAMP和RT-PCR2种不同方法的检测灵敏度。【结果】建立了检测番茄不孕病毒的LAMP技术;LAMP比RT-PCR具有灵敏度更高、快速、简便等优点。【结论】建立的LAMP技术能快速、准确、简便地检测出菊花中的番茄不孕病毒。

番茄不孕病毒(TAV)脱除对怀白菊叶绿素含量及氮代谢相关指标的影响

【目的】探究番茄不孕病毒(TAV)脱除对怀白菊叶绿素含量和氮代谢水平的影响,为怀白菊脱毒苗的大田推广应用提供理论依据。【方法】以前期获得的TAV脱除怀白菊试管苗为试材,以未经脱除TAV的试管苗为对照(CK),对两者进行继代培养,并测定培养过程中叶片叶绿素含量及氮代谢的相关生理指标。【结果】继代培养过程中,CK与TAV脱除怀白菊试管苗叶片的叶绿素α和叶绿素b含量随培养天数的增加而升高,两者均以继代第22 d时的增幅最大,分别为5.24%和41.69%。与CK相比,TAV脱除提高了相同培养天数时叶片的叶绿素a、叶绿素b含量,且差异达显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01)水平。怀白菊脱除TAV病毒后,其硝酸还原酶(NR)活力、游离脯氨酸和可溶性蛋白含量在继代培养过程中均显著高于CK,三者最大增幅分别为27.99%(继代22 d)、28.10%(继代22 d)和5.89%(继代38 d)。【结论】TAV脱除能有效提高怀白菊的叶绿素含量及氮代谢水平,利于其生长发育。

切花菊的番茄不孕病毒脱除技术研究

番茄不孕病毒是福建省切花菊病毒病的主要病原病毒，平均带毒率高达８５．９％。为探讨其脱毒技术及其可行性，以福建省种植的菊花品种为试验材料，采用①热处理（白天４０℃、夜间３０℃，５～２０ｄ），②热处理结合茎尖培养，③热处理结合茎尖培养再二次培养等３种处理，经生物学鉴定、电镜观察和间接酶联免疫吸附试验检测（ＩＤ－ＥＬＩＳＡ），３种处理的脱毒率分别为１３．３％～２０．０％、４１．６％～６０．０％和８３．３％～９０．０％。此外，还进行了不同品种和外植体长度对切花菊组织培养的诱导率及脱毒率的影响试验。结果表明，热处理（白天４０℃、夜间３０℃，１０～２０ｄ）结合茎尖培养（取茎尖０．５～１．０ｍｍ）再二次培养是脱除切花菊的番茄不孕病毒的最有效方法，可在大田生产中应用推广。

侵染菊花的番茄不孕病毒的鉴定及其外壳蛋白基因的克隆

从菊花花叶病标样中分离到一球形病毒分离物 ,直径 2 5～ 2 9nm ,与TAV抗血清反应呈阳性。根据英国报道的番茄不孕病毒 (TAV En)CP基因序列 ,设计合成一对引物 ,对该病毒RNA进行RT PCR扩增 ,得到与预期大小相符的特异扩增带。将其克隆到 pGEM Teasy中 ,经酶切和序列分析表明所克隆的是TAVCP基因 ,与已知的 6个株系相应序列同源性均在 96 .

番茄不孕病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

番茄不孕病毒(tomato aspermy virus,TAV)是危害我国菊花生产的主要病毒之一。本研究根据该病毒外壳蛋白北京分离物的基因,设计特异性引物与荧光探针,建立了基于TaqMan探针的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与DAS-ELIAS相比,检测灵敏度提高了约1 000倍,重复性试验表明批内与批间变异系数均在5%以内,整个检测过程仅需2 h,是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、快速有效的TAV检测方法。

侵染菊花的番茄不孕病毒

田间采集的菊花病毒病标样13^(?),能侵染菊花,病株表现出轻度花叶、斑驳;侵染烟草和心叶烟表现出花叶、畸形,叶背形成耳突症状;侵染番茄表现出花叶与畸形;还能使苋色藜、昆藜表现局部斑。寄主范围广泛,能侵染菊科、茄科、藜科等多种植物,并能通过汁液、蚜虫传毒。电镜负染或超薄切片可观察到球状病毒粒子,直径为28～30nm。紫外吸收光谱表现为典型核蛋白吸收峰。A260/280=1.7974.与番茄不孕病毒(TAV)有血清反应,而与CMV无血清反应。因此认为13^(?)分离物是番茄不孕病毒。

两重RT-PCR同步检测菊花B病毒和番茄不孕病毒

根据已报道的菊花B病毒(CVB)和番茄不孕病毒(TAV)外壳蛋白基因序列合成两条寡核苷酸引物,用RT-PCR的方法对这两种病毒的外壳蛋白基因进行了扩增,得到与预期大小相符的特异扩增条带。将其克隆到pGEM-T中,经序列分析表明所克隆的是CVB和TAV的CP基因,与已知的序列相比,CVB的同源性分别为82%、85%,而TAV的同源性为98%。利用两重RT-PCR成功同步检测这两种病毒,从而建立了一种能同时检测两种病毒的快速、简便、灵敏的分子检测方法。

菊花B病毒和番茄不孕病毒RT-RPA双重荧光实时检测体系的构建与性能评价

菊花B病毒(Chrysanthemum virus B, CVB)和番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus, TAV)是危害菊花的2种主要优势病毒。为构建一种同步检测CVB和TAV逆转录重组酶聚合酶恒温核酸扩增(Reverse transcriptionrecombinase polymerase amplification, RT-RPA)双重荧光实时检测方法,本研究以CVB和TAV编码外壳蛋白(coat protein, CP)基因保守区域作为靶标设计RIA引物和探针,CVB和TAV探针的5’端分别标记FAM和VIC荧光素,通过对商业化的RT-RPA试剂筛选,引物探针的组合筛选,扩增体系的优化和扩增条件的摸索试验,构建了一种可同时用于CVB和TAV检测的RT-RPA双重荧光实时检测方法。并对该体系进行优化,优化后RT-RPA双重荧光扩增体系中CVB和TAV的最优引物浓度为400 nmol/L,最优探针浓度分别为100 nmol/L和120 nmol/L;最适反应温度为39℃,最适反应时间为15 min。在此扩增体系和条件下,对CVB和TAV的检测敏感性均为1拷贝/μL;对烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、菊花矮化类病毒和褪绿斑驳类病毒核酸检测结果为阴性,对菊花B病毒、番茄不孕病毒核酸检测结果为阳性;对1.0×10^(4)拷贝/μL和10拷贝/μL的高、低两种浓度的质粒平行检测10次,检测荧光出现阳性扩增拐点所需的时间T变异系数均小于5%,重复性好。采用RTRPA和RT-qPCR方法同步对实验室留存的有症状的100株菊花进行核酸提取并检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,总符合率100%。因此,本研究建立了一种能同时检测CVB和TAV的快速、灵敏的RT-RPA双重荧光实时检测方法。

番茄不孕病毒(TAV)脱除对‘怀白菊’活性氧代谢的影响

以前期获得的脱除番茄不孕病毒(TAV)的‘怀白菊’试管苗为试材,从同工酶谱和DNA分子简单序列间重复(ISSR)多态性方面分析其遗传稳定性,在此基础上,对其继代培养过程中叶片中的活性氧代谢进行了研究。结果表明,TAV脱除没有改变‘怀白菊’叶片中SOD、POD同工酶谱带及ISSR扩增条带的数目,但相应同工酶谱带亮度增强;也没有改变‘怀白菊’试管苗继代培养过程中膜脂过氧化相关指标(O2ˉ·生成速率及H2O2和MDA含量)和保护系统相关指标(保护酶SOD、POD、CAT、APX和GR,抗氧化物质GSH和As A)的变化趋势,但却显著降低了相同时间点膜脂过氧化相关指标的绝对值,降幅最大值超过30%(O2ˉ·生成速率、MDA含量),显著增加了保护酶活性及抗氧化物质的含量,增幅最大值超过了50%(APX活力、GSH含量)。以上说明,TAV脱除不仅没有改变‘怀白菊’的遗传稳定性,而且降低了其活性氧代谢水平,提高了其抗氧化能力。

侵染菊花和风信子的番茄不孕病毒的鉴定

1986年先后在北京的公园采到菊花病样4个,北京动植检所送检风信子球茎病样一个。这5个分离物经人工接种10科36种植物,多表现花叶、斑驳、畸形等症状,而番茄的果实小而无籽。以菊-6分离物制备的抗血清与其它4个分离物产生明显愈合的沉淀线,证明它们的抗原性完全相同,这5个分离物与从菜豆分离的番茄不孕病毒(TAV)的抗血清反应产生分枝状的明显沉淀线。菊-6分离物的理化特性:TIP为55—60℃,DEP为10^(-2)—10^(-4),LIV为2天。其病毒粒子的平均直径为27nm等轴多面体,0.D260/280=1.76,病毒衣壳旦白分子量约为26300。根据上述以菊-6分离物为代表的5个分离物的特性与CMI/AAB Descriptions ofPlant Viruses No.79.1971所描述的从菊花分离的TAV基本相同,鉴定它们属TAV,但与菜豆分离物不完全相同,属不同株系。

ODA_H_2O_2-HRP偶合反应伏安酶联免疫分析检测植物病毒GFV、TAV和PVY

将邻联茴香胺（ＯＤＡ）＿Ｈ２Ｏ２＿辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）偶合反应伏安酶联免疫分析新体系，应用于植物病毒葡萄扇叶病毒（ｇｒａｐｅｖｉｎｅｆａｎｌｅａｆｖｉｒｕｓ，ＧＦＶ）、番茄不孕病毒（ｔｏｍａｔｏａｓｐｅｒｍｙｖｉｒｕｓ，ＴＡＶ）和马铃薯Ｙ病毒（ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹ，ＰＶＹ）的测定。该法对以上各种植物病毒叶澄清液的测定的稀释比均高于酶联免疫吸附分析（ＥＬＩＳＡ）法，检测范围均宽于ＥＬＩＳＡ法。

郑州地区2种菊花病毒CP基因的克隆与序列分析

为了探明郑州地区感病菊花上病毒的种类及来源,采集有明显病症的菊花样品,根据已知的番茄不孕病毒(TAV)和菊花B病毒(CVB)的基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR扩增其外壳蛋白(CP)基因的方法对这2种病毒进行了检测,然后进行序列同源性及系统进化分析。结果显示,所得TAV的CP基因序列长度为481 bp,NCBI登录号为KU873003;所得3条CVB的CP基因序列长度均为547 bp,NCBI登录号分别为KU873004、KU873005、KU873006。将郑州分离物的CP基因与NCBI上已登录的其他分离物进行比对,TAV核苷酸序列同源性为91%~99%,氨基酸序列同源性为86%~100%;CVB核苷酸序列同源性为76%~99%,氨基酸序列同源性为77%~99%。系统进化分析表明,菊花TAV郑州分离物与北京分离物KP019201、黑龙江分离物KP019202、河南分离物KP019200和山西分离物KP019204的亲缘关系最近;CVB郑州分离物与印度分离物AJ812569、AJ871367的亲缘关系最近。

菊花上2种病毒的检测及其部分外壳蛋白基因序列分析

采集昆明地区花卉基地和公园的269份菊花样品,调查并分析侵染菊花的番茄不孕病毒(Tomatoaspermy virus,TAV)和菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)的发病状况。ELISA和RT-PCR检测结果表明,TAV和CVB在菊花植株上的发病率分别为4.62%和16.70%。对3个TAV分离物和8个CVB分离物的外壳蛋白(coat protein,CP)基因的部分序列进行测定,并分别与GenBank登录的TAV和CVB序列进行比对和系统进化分析,结果显示各TAV分离物的CP基因核苷酸序列同源性为85.04%～98.02%。在系统进化树中聚集的2个簇中,昆明分离物都在同一簇。CVB的CP基因存在较明显的序列变异,核苷酸序列同源性为75.09%～84.99%,在系统进化树中聚为3个簇,昆明分离物均集中在同一簇。

突变和重组可克服异源复制酶在病毒复制中的功能缺陷

异源复制酶的组合无法有效地支持重组病毒的复制是雀麦花叶病毒科病毒存在的普遍现象。利用雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属的典型成员黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和番茄不孕病毒(tomato aspermy virus,TAV)作为研究对象,分析2个复制酶的异源组合对重组病毒复制的影响。通过农杆菌浸润,将CMV RNA1(C1)和TAV RNA2(T2)进行异源组合,并将此与CMV RNA3(C3)或TAV RNA3(T3)混合侵染本生烟。接种后10 d,C1T2C3和C1T2T3接种的植物没有出现明显的病毒症状,通过Northern杂交,在系统叶中仅检测到微弱的病毒特异条带,这说明C1T2的异源组合无法高效地支持病毒的复制和侵染。当C1T2C3转接3代之后,接种的本氏烟植株表现明显的病毒症状,且病毒RNA的积累水平显著增加。病毒基因组RNA的测序结果显示,C1第1 390位、T2第1 695位发生点突变,而且C3的3'末端融合了T2的完整3'UTR序列。以上结果表明,通过病毒的突变或/和重组可有效提高异源复制酶对重组病毒的复制效率。

河南开封与湖北荆门地区菊花病毒病的检测与比较分析

病毒病是影响菊花生产的重要因素,为了解河南开封地区与湖北荆门地区菊花生产中的病毒发生情况,比较不同地区菊花感染病毒病的区别,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测技术,对常在菊花中出现的5种病毒:菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)、菊花矮化类病毒(Chrysanthemum stunt viroid,CSVd)、马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)进行检测。结果表明,菊花B病毒、番茄不孕病毒是使菊花感病的优势病毒,在河南开封地区较为常见,而马铃薯X病毒仅在较少的开封菊花品种中检测到,菊花矮化类病毒、马铃薯Y病毒在开封菊花中均未检测到。而湖北荆门地区菊花病毒种类较少,除少数品种检测到菊花B病毒外,番茄不孕病毒、菊花矮化类病毒、马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒均未被检测到。以上结果说明,菊花B病毒、番茄不孕病毒可以作为病毒病的首要防治目标,可以减少对其他病毒的施药防治,从而减少施药对菊花生长的影响,以及减少菊花的种植成本和工作量。

菊花上番茄斑萎病毒的血清学检测及分子鉴定

菊花是一种重要的花卉和药用植物,受到病害侵染时,其会失去观赏价值。目前我国报道的侵染菊花的病毒种类主要有菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)等。

‘增城蜜菊’茎尖培养脱毒技术

菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)和番茄不孕病毒(Tomatoaspermy virus,TAV)是侵染菊花的主要病源病毒,影响了‘增城蜜菊’的产量和品质。采用不同茎尖诱导培养基、不同茎尖切取长度,研究了‘增城蜜菊’脱毒苗的获得方法。结果表明,在本试验中,培养基中加入椰子汁可以提高茎尖诱导率,最佳茎尖诱导培养基为MS+6-BA0.1mg/L+椰子汁100ml/L+蔗糖30g/L。以‘增城蜜菊’组培苗为材料,切取0.5mm茎尖为外植体时,诱导率为52.67%,RT-PCR检测所获得的苗都为脱毒苗。建立了‘增城蜜菊’茎尖脱毒技术体系,可以生产上推广应用。

3种菊花病毒/类病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的构建与准确性评价

菊花容易受到病毒感染而造成品质下降,目前国内对菊花病毒的检测主要根据外观表现或者定性PCR检测,无法准确判定病毒载量。为构建一种可同时用于检测菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)和菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chloritic mottle viroid,CChMVd)的实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究分别以保守区域作为靶标设计相应的引物探针,通过优化扩增体系中CVB、TAV、CChMVd 3种病毒/类病毒探针浓度、引物浓度、Mg^(2+)浓度、dNTPs浓度,摸索扩增程序中反转录时间、退火温度和扩增循环数,构建了一种可同时用于CVB、TAV、CChMVd的3重实时荧光定量RT-PCR检测体系,优化后的扩扩增体系中CVB、TAV和CChMVd的探针浓度分别为100 nmol/L、120 nmol/L和80 nmol/L,引物浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和160 nmol/L,Mg^(2+)浓度为3.0 mmol/L;dNTPs浓度200μmol/L;最适反转录时间为25 min,退火温度为60℃,循环数为40。敏感性实验结果表明,该反应体系对3种病毒/类病毒的敏感性为1.0×^(10)3拷贝/mL,敏感性好;定量线性范围为1.0×^(10)3拷贝/mL~1.0×^(10)10拷贝/mL,线性范围宽;特异性好,对菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒核酸检测结果为阴性;对1.0×^(10)4拷贝/mL的低浓度参考品平行检测10次,定量结果lg值偏差(CV%)为4.81%,重复性好。在南京农业大学"中国菊花种质资源保存中心"基地随机选择菊花20株进行本研究试剂检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,其病毒载量为2.5×^(10)4拷贝/mL~5.5×^(10)7拷贝/mL,随机选择1株CVB病毒株定量PCR,产物进行TA克隆后经测序与NCBI Blast比对,其与MH678704.1的同源性为100%。因此,本研究建立了一种能同时检测CVB、TAV、CChMVd 3种菊花常见病毒/类病毒的灵敏、快速、可定量的检测方法。