中华蹄盖蕨挥发油对番茄溃疡病菌的抑菌效果及机理研究

为研究中华蹄盖蕨挥发油对番茄溃疡病菌(Cmm)的抑菌效果及机理,以平板打孔法和浊度法测定中华蹄盖蕨挥发油对Cmm的抑菌效果。抑菌机理主要包括细胞壁、细胞膜和细胞周期3个方面,测定胞外碱性磷酸酶(AKP)活性以分析对细胞壁的作用,测定胞内活性氧、胞外可溶性蛋白泄漏量、细胞膜电位、ATP酶活性以分析对细胞膜的作用,最后测定细胞周期。研究发现,中华蹄盖蕨挥发油抑菌圈直径是(19.06±1.83)mm、最小抑菌浓度为0.313 mg/mL,表明中华蹄盖蕨挥发油对Cmm有明显抑制作用。中华蹄盖蕨挥发油作用后,使Cmm胞外AKP活性、活性氧水平和胞外可溶性蛋白泄漏量显著(P<0.05)升高,细胞膜电位、ATP酶活性显著(P<0.05)降低,处于DNA复制期的Cmm占比降低。中华蹄盖蕨挥发油对Cmm具有显著抑菌效果。其抑菌机理为破坏细胞壁导致胞外AKP活性升高,破坏细胞膜导致活性氧水平和可溶性蛋白泄漏量显著(P<0.05)升高,出现细胞膜去极化及ATP酶活性显著(P<0.05)降低现象,最终干扰了正常的细胞周期。

番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测方法研究

根据番茄溃疡病菌ITS(16S^23SrDNA间隔区)基因序列,设计并合成了荧光PCR检测引物(Fan1和Fan2)及特异性检测探针(Fanprobe),对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株实时荧光PCR反应。结果表明,番茄溃疡病菌PCR产物出现强烈的特异杂交信号,而非番茄溃疡病菌均未出现特异荧光信号,证明这对引物及探针具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将番茄溃疡病菌DNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果表明,此体系可检出52.3 fg/μL的模板。

番茄溃疡病菌PCR快速检测技术

番茄溃疡病是一种严重危害番茄生产的细菌性病害,许多国家将其列为检疫性病害。利用ITS通用引物扩增了番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)的ITS序列,并进行克隆测序。根据序列比较结果设计了引物BT1和BT2,该引物特异性好,能专一扩增出268bp电泳条带,而马铃薯环腐病菌等不同亚种、不同属的细菌及健康的番茄材料均无扩增条带。从接种但未显症番茄苗叶片及人工模拟染菌种子上提取总DNA,以此为模板均能稳定地扩增出特异性目的条带。该方法直接对种子或植株进行检测,不需进行病原菌分离培养,快速简便,适用于出入境检验检疫及种苗健康检测领域。

番茄溃疡病菌LAMP快速检测方法的建立

以SYBR Green I为指示剂,建立了番茄溃疡病菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。根据番茄溃疡病菌特异的核糖体转录间隔区序列设计了4条引物进行LAMP扩增,通过对体系中各成分进行优化,最终确定25μL反应体系中模板200ng,MgSO4的适宜浓度为3.0mmol/L,Bst DNA聚合酶2U,dNTPs的适宜浓度为0.3mmol/L,外引物与内引物之比为1∶3时扩增效果较好,在65℃最佳反应时间为40min。在优化的体系条件下,获得的反应产物经SYBR Green I染色后,肉眼观察检测灵敏度可达到50CFU/mL,且对番茄溃疡病菌的检测具有高度的特异性。结果表明,该方法快速、准确、灵敏、特异,具有良好的实用性。

番茄溃疡病菌的环介导等温核酸扩增技术检测方法

目的建立番茄溃疡病菌的环介导等温核酸扩增技术检测方法。方法应用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)对番茄溃疡病菌的16SrRNA特异性基因进行扩增,采用4对引物识别目的片段的6个特异性区域,62℃恒温1h完成扩增。结果设计的引物与对照菌皱纹假单胞菌、茄假单胞菌、丁香假单胞菌番茄致病变种都没有扩增反应,表现了较好的特异性。这些对照菌在茄科蔬菜上易引起类似症状。结论 LAMP检测程序便捷,所需设备简单,其结果可以通过肉眼观察来判断,比常规PCR灵敏且能更早得到反应结果,因此该技术具有更大的优势。

EMA-qPCR方法快速检测番茄溃疡病菌活菌研究

将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-q PCR),建立一种有效快速检测番茄溃疡病活菌的方法。以番茄溃疡病菌Pat-1基因为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行q PCR特异性扩增。结果显示,q PCR检测灵敏度为1.0×101CFU/m L;当EMA的浓度为2.0μg/m L时,能有效抑制1.0×107CFU/m L灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×101~1.0×105CFU内,每个q PCR反应体系中活菌CFU数与Ct值呈线性相关(R2=0.987)。不同温度处理后EMA-q PCR检测番茄溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,表明待检样品可在4和20℃短期保存。对疑似带病番茄种子样品进行EMA-q PCR检测,发现EMA-q PCR方法能减少番茄溃疡病菌PCR检测的假阳性结果。本研究建立的EMA-q PCR方法是一种能有效检测番茄溃疡病活菌的方法,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。

番茄溃疡病菌检测技术研究进展

概述了几种常见的番茄溃疡病菌检测技术,包括血清学检测技术、PCR技术、实时荧光PCR技术、Rep-PCR技术、核酸分子杂交检测技术,并对番茄溃疡病检测技术进行了展望。

不同来源番茄溃疡病菌致病力差异研究

采用打顶法接种、半选择性培养基再分离发病植株中的病原菌，以及特异性PCR验证方法，对来自3个国家9个不同地区的46株番茄溃疡病菌进行了致病性测定，以病情指数评价不同菌株的致病力。结果显示，分离自我国河北滦平县、内蒙古包头市等地的24株菌株的病情指数达到75以上，属于强致病力水平；11株菌株的病情指数为50-75，属于中等致病力；而9株菌株的病情指数为50以下，属于弱致病力；检测同时证实，有2株属于无致病力菌株。强致病力、中等致病力、弱致病力和无致病力菌株占供试菌株总数的比例分别为52．2％、23．9％、19．6％和4．3％，表明供试的46株番茄溃疡病菌存在不同程度的致病力差异。

内蒙古地区番茄溃疡病菌PCR快速检测技术及22个番茄品种种子表面带菌检测

为快速检测番茄种子表面的带菌情况,以便及时有效防控番茄溃疡病,从而减少病害损失。试验用细菌基因组DNA试剂盒提取番茄溃疡病的总基因组,用通用引物进行PCR反应。以番茄溃疡病菌的DNA为模板,使用专一性引物进行PCR扩增,通过对专一性引物的筛选,最终确定了Cla F1-Cla F2为快速检测番茄溃疡病菌PCR的特异性引物。该检测方法特异性强、灵敏度高,模拟种子带菌,对浸种水的检测灵敏度达1×105CFU/m L。经PCR快速检测,22个番茄品种中只有黑贝番茄、粉红番茄和保罗塔带有番茄溃疡病菌,其余19个品种均未带菌。该方法直接对种子进行检测,不需进行病原菌分离培养,快速简便。

中华蹄盖蕨抗番茄溃疡病菌活性物质提取工艺优化及其抑菌作用研究

本研究以获得抗番茄溃疡病菌的植物源活性物质为目的。在单因素实验基础上以抑菌活性为指标采用有交互作用的正交试验设计L27(313),确定中华蹄盖蕨抗番茄溃疡病菌活性物质的提取工艺。将所得活性物质作用于番茄溃疡病菌,测定菌体内活性氧、细胞内蛋白含量、细胞外蛋白含量的变化。结果表明,料液比和提取温度对活性物质的抑菌效应有极显著影响,且它们之间的交互作用有显著影响。确定最优提取条件为料液比1∶10 g/mL、提取温度80℃、提取时间8 h,其抑菌圈直径为27.33 mm。中华蹄盖蕨活性物质处理番茄溃疡病菌后,胞内活性氧水平明显升高,细胞外蛋白含量增加,细胞内蛋白含量降低。以上研究可得,以中华蹄盖蕨为原料可获得有效抗番茄溃疡病菌的活性物质,为该病菌的防治提供新的途径。

海带石油醚相活性物质对番茄溃疡病菌的抑菌机理

旨在揭示海带活性物质抑制番茄溃疡病菌的作用机理,为绿色抑菌剂的开发提供理论依据。以活性追踪法获得海带抗菌成分,从扫描电镜、膜电位、活性氧、胞内蛋白、细胞周期多角度进行机理研究。追踪检测结果表明,海带石油醚萃取相抑菌效果最佳(P<0.05),其抑菌圈直径为26.00 mm。抑菌机理研究结果表明,海带活性物质作用后番茄溃疡病菌细胞形态发生明显变化、膜两侧电位与对照组相比下降可达17.49%~56.60%、胞内活性氧含量增长1.19~3.98倍、胞内蛋白含量显著减少(P<0.05)、处于细胞分裂期的番茄溃疡病菌占比明显降低。研究结果揭示出海带活性物质主要作用病菌细胞膜,造成自由基累积、阻滞正常传代,最终达到杀灭病菌的效果。

基于锁式探针的番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测

【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,CMM),一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接,再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针,最后以环化的锁式探针为模板,在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法,分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异,并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM,在供试的10种菌株中,只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性,空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加,检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法,其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高,DNA最低浓度检测为50 fg·μL-1,而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg·μL-1,灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测,结果显示,45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性,分别是日本的番茄种子样品2份(编号Jap1214、Jap1102),永泰采集的样品2份(编号为Yongt1001、Yongt1002)和闽清采集的样品1份(编号为Minq1001)。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测,可以直接从番茄种子中检测到CMM,该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测,有较好的口岸检疫实际应用价值。

应用分子生物学方法快速检测番茄溃疡病菌的研究

根据番茄溃疡病菌的tomA基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应。结果,番茄溃疡病菌的PCR产物出现301bp的特异性扩增条带,而非番茄溃疡病菌均未出现扩增条带,证明这对引物具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将分离的番茄溃疡病菌做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度。结果表明,此体系可检出106CFU/mL番茄溃疡病菌菌液提取的模板。

以cytC基因为靶标的LAMP快速检测番茄溃疡病菌方法的建立

以番茄细菌性溃疡病病菌的特异性基因cytC为检测靶标,以番茄溃疡病病菌等8种病原细菌为供试菌株。根据检测靶标设计环介导等温扩增(LAMP)引物并进行特异性和灵敏度检测。结果显示,引物cytC-170能特异性检测出番茄溃疡病病菌,检测灵敏度高达5×10^(5) copy/μL,环引物的加成将试验进程缩短为33.06 min,使整个反应控制在50 min内。研究建立的LAMP检测方法操作简单,结果可视,非常适用于番茄细菌性溃疡病病菌的现场快速检测。

番茄溃疡病菌分子检测取得新进展

在国家自然基金的资助下,中国农业大学植物病理学系教授李健强带领的研究团队经过多年研究,建立了番茄溃疡病菌快速灵敏的分子检测方法,为生产中病菌的鉴定和田间病害的诊断提供了可靠依据。

番茄溃疡病菌传入河南的风险分析及对策探讨

番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)为全国农业植物检疫性有害生物,已在国内部分区域分布,河南尚未有分布。基于相关报道,介绍了该菌的形态特征、侵染特点、鉴定方法、发病症状等,并评估该菌传入河南的风险性,经赋值与计算,得出其危险性综合评估值R=0.839,判定该菌传入河南的风险性很大。结合前人的研究进展与实践经验,提出具有针对性的防控措施。

番茄溃疡病菌LAMP可视化检测方法的建立

以番茄细菌性溃疡病菌等7株病原细菌为检测材料,以特异性基因tom A为检测靶标,设计LAMP引物tom A-107、tom A-8和相应的环引物tom A-107LF21、tom A-107LB21。针对靶标基因进行引物筛选及引物的特异性和灵敏度测试,结果表明:tom A-107能特异性检测出番茄细菌性溃疡病菌,检测灵敏度达5×10^(2)copy/μL,环引物的加成将反应进程缩短三分之一,使整个检测过程控制在50 min内完成,该方法非常适用于Cmm菌株的现场快速检测。

超分支滚环扩增技术快速检测番茄溃疡病菌

根据番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,cmm)的一段特异致病基因pat-1序列,按照锁式探针的设计原理设计探针和扩增引物,优化系列反应条件,建立了特异性的cmm超分支滚环扩增技术。实验结果表明该检测技术能够从供试的10种菌中特异性地检出番茄溃疡病菌,检测灵敏度高,DNA最低检测浓度为500 fg/μL。

番茄溃疡病菌的PCR-DHPLC快速检测

根据番茄溃疡病菌ITS序列,设计并合成了PCR-DHPLC检测引物,对番茄溃疡病菌及其他病菌共10个标准菌株进行了PCR-DHPLC检测。结果表明,番茄溃疡病菌的PCR-DHPLC检测图谱出现了特异性吸收峰,而其他病菌均未在相同洗脱时间出现吸收峰,说明这种方法具有检测番茄溃疡病菌的特异性。灵敏度实验结果表明,PCR-DHPLC体系与PCR-琼脂糖凝胶电泳体系的检测灵敏度一致。研究表明,PCR-DHPLC方法是一种特异、灵敏、快速的番茄溃疡病菌检测方法。

番茄溃疡病菌单克隆抗体的制备与鉴定

为制备并鉴定番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,Cmm)的单克隆抗体(McAbs),用全菌皮下免疫BALB/C小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,经免疫、融合、间接ELISA筛选和克隆等,获得稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株,得到了抗番茄溃疡病菌的单克隆抗体。经免疫后获得3株单抗分别为1A4、1C3和1B7,经亚类鉴定分别是IgM、IgG1、IgG1;纯化腹水间接ELISA效价分别为1:3.2×106、1:8.1×105、1:3.2×106;与其他同属不同亚种无交叉反应。结果表明:3株单克隆抗体均具有较高特异性和敏感性,可作为番茄溃疡病菌的检测抗体,其中,1A4的效果最好。番茄溃疡病菌单克隆抗体的获得为进一步研发番茄溃疡病检测试剂盒奠定了基础。