青蒿中番茄斑萎病毒和烟草花叶病毒的分子鉴定及相关序列分析

番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)是2种重要的植物病原病毒,对多种经济作物的产量和品质均造成严重影响。2021年-2022年,在云南省丽江市烟草种植区不同烟区采集叶片黄化、皱缩以及无症状的青蒿Artemisia caruifolia样品共计14份,利用免疫金标速测卡和RT-PCR对其病原病毒进行检测。利用免疫金标速测卡检测结果显示,在所检样品中有9份样品检测出TSWV,检出率为64.28%,有3份样品检测出TMV,检出率为21.43%,2种病毒复合侵染的检出率同样为21.43%;利用RT-PCR对复合侵染的3份样品进行分子检测,结果显示,在3份复合侵染青蒿样品中获得3条TSWV N基因序列、3条TMV cp基因序列和2条TMV RdRp部分序列。TSWV青蒿分离物与分离自云南的TSWV-2分离物相似性最高,为99.6%;TMV青蒿分离物与分离自辽宁的TMV-Shenyang分离物和分离自云南的TMV-Yongren-1相似性最高,均大于99.4%。这是首次发现TSWV和TMV 2种不同属病毒复合侵染青蒿。

基于RPA-CRISPR/Cas12a的番茄花叶病毒可视化检测方法的建立

番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)属于植物杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒属Tobamovirus成员,主要危害番茄和辣椒,多数茄科植物易感染,严重影响果实的品质和产量。本研究根据ToMV编码的外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)特异性引物和簇状规则间隔短链重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白12a(CRISPR-associated 12a,Cas12a)的crRNA并挑选报告基因。通过优化反应体系建立了ToMV的快速可视化检测方法,当荧光报告基因FQ终浓度为400 nmol/L、Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol·L^(-1)/1000 nmol·L^(-1)时检测信号最强,只需RPA和CRISPR/Cas12a分别反应15 min,即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信号。该方法可特异性检测ToMV,对携带ToMV样品的RNA检测灵敏度可以达到172 ag/μL,是普通RT-PCR检测灵敏度的10000倍,可用于ToMV快速灵敏的可视化检测。

番茄花叶病毒种传机制研究及干热处理效果评价

番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)是世界性分布的病毒,寄主范围广泛,番茄是其主要寄主,严重影响番茄生产。本研究以带毒的番茄种子为材料,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测病毒在番茄种子内的定位,采用干热方法处理种子后检测番茄种子的萌发率及ToMV的钝化率,旨在筛选出一个既可以有效钝化病毒,又不影响番茄种子萌发的处理条件,从源头上控制该病害的发生和流行。结果发现,ToMV定位于番茄种子的种皮,胚乳及胚中没有检测到该病毒的存在。对番茄种子进行干热处理,与未处理的番茄种子相比,75℃处理48 h和70℃处理96 h均会显著影响番茄种子的萌发,80℃处理24 h和65℃处理120 h对番茄种子的发芽率均没有显著影响。4个温度的恒温处理均可以有效降低种子携带ToMV的数量,但通过荧光定量PCR仍均能检测到ToMV。80℃处理24 h对ToMV的清除效果最好,且不影响番茄种子的发芽率。

番茄斑驳花叶病毒在广东省的首次报道

番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus, ToMMV)是2013年发现的烟草花叶病毒属一个新种,目前在多国(地区)有发生。本文采用小RNA深度测序及RT-PCR检测方法在广东省广州市南沙区辣椒疑似病样中检测到ToMMV,命名为番茄斑驳花叶病毒广东分离物(ToMMV-GD-2020)。采用RT-PCR分段扩增获得了ToMMV-GD-2020的基因组全序列,该分离物基因组全长6 399 nt,包含4个开放阅读框,分别编码4个蛋白。序列相似性分析表明,ToMMV-GD-2020与已登录GenBank的14个ToMMV分离物基因组序列相似性分别为99.0%~99.7%,其中与中国辽宁分离物ToMMV-LN(GenBank登录号:MN853592)的相似性最高(99.7%),与危害我国番茄、同属烟草花叶病毒属的番茄花叶病毒(tomato mosaic virus, ToMV)、番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV)代表分离物的相似性分别为84.6%和81.0%。系统进化分析表明,ToMMV-GD-2020与该病毒各分离物亲缘关系均较近,与中国辽宁分离物亲缘关系最近。利用ToMMV的PCR特异引物对广东其他6个市采集的67份辣椒疑似病毒病样品进行检测,结果均为阴性,这说明ToMMV目前还是局部危害广东省辣椒。本文是首次报道在广东发现ToMMV,对监测ToMMV在我国的扩散具有重要意义。

广西番茄花叶病毒和番茄褪绿病毒的分子鉴定

为明确引起广西番茄呈现褪绿斑驳和花叶症状的病毒病原,采集4个疑似病毒感染的番茄样品,利用小RNA深度测序、RT-PCR、序列分析、遗传进化树的构建等方法对样品进行鉴定及遗传进化分析。研究结果发现,小RNA数据中的41条contigs分别被注释为番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)和番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus,ToCV);RT-PCR证实了s RNA的结果,且所有样品均存在ToMV和To CV的复合侵染。通过拼接获得ToMV和ToCV RNA2的近全基因序列,ToMV近全基因序列为6383 bp,命名为ToMV-GX;ToCV RNA2的近全基因序列为8031 bp,命名为ToCV-GX。进化树分析发现,本研究获得的ToMV-GX与ToMV中国山西、内蒙古、呼和浩特3个分离物处于一个分支,说明其具有较近的亲缘关系;ToCV-GX与ToCV中国台湾、广东分离物处于一个大分支,说明具有较近的亲缘关系。上述结果证实,引起广西番茄呈现褪绿斑驳和花叶症状的病原是To MV和ToCV,本研究是ToMV和ToCV复合侵染广西番茄的首次报道。

本氏烟组蛋白H4与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染

以番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)外壳蛋白(Coat protein,CP)为研究对象,通过荧光素酶互补技术(Luciferase complementation imaging assay,LCI)研究ToMMV CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内的互作情况。亚细胞共定位结果显示,ToMMV CP定位于细胞核和细胞质中,组蛋白H4定位于细胞核中,两者共定位于细胞核中。双分子荧光互补(BiFC)试验结果表明,ToMMV CP与组蛋白H4的互作位置主要在细胞核中。上述2种试验结果证明,烟草花叶病毒CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内存在互作。采用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术沉默本氏烟烟草中的H4基因,对沉默H4基因的植株接种ToMMV,接种后第4 d,通过实时荧光定量PCR检测方法检测系统叶的病毒含量,发现病毒含量显著低于对照组,结果表明H4基因的沉默会影响ToMMV在植株中的复制,组蛋白H4可能是ToMMV侵染植株的本氏烟感病因子。病毒编码的CP可能与寄主组蛋白H4在细胞核内发挥作用,进而使病毒完成系统侵染。

番茄Tm-2^2基因在烟草中的表达及其对番茄花叶病毒（TOMV）的特异抗性

Tm-22基因在烟草上的转化和表达表明,Tm-22基因在同科不同属植物体上的功能没有改变。在两种类型的纯合转化体上,Tm-22基因编码蛋白能够抗Tobamovirus属5种不同的毒株,并能被ToMV-2a毒株感染而失去抗病性。这个结果表明:移动蛋白上的氨基酸变异能够影响R蛋白对ToMV的应答反应。Tm-22基因转化体在不同启动子的调控下,对ToMV-2a毒株感染所表现的症状不同,说明启动子在Tm-22基因的抗病反应中具有非常重要的作用。

大黄提取物对番茄花叶病毒(ToMV)病防治机理的初步研究

本研究表明：大黄提取物对ＴｏＭＶ粒体具有钝化作用，但在电镜下没有观察到在形态、长度方面与对照的差异；大黄提取物使接种心叶烟叶片上枯斑直径比对照减小了２１．９％；接种前喷施大黄提取物的植株过氧化物酶（ＰＯ）活性比对照高，接种后，处理株的ＰＯ活性第１２天达到高峰，而对照的最高峰比处理提前６ｄ；接种ＴｏＭＶ前处理的番茄与对照相比，新增１条ＰＯ同工酶酶带，接种后，虽然处理与对照都增加２条高迁移率（Ｒｆ＝０．８２６，０．８６７）同工酶酶带，但处理株出现的晚；经大黄提取物处理的番茄植株与清水处理的植株相比，ＰＲ蛋白总带数相同，但处理的各带强度高于对照。

通过大规模突变体筛选鉴定到番茄花叶病毒易感因子SlOSCA4.1助力抗病毒作物育种

2023年7月13日,国际著名杂志《Plant Biotechnology Journal》在线发表了题为“The tomato calciumpermeable channel 4.1(SlOSCA4.1)is a susceptibility factor for pepino mosaic virus”的研究论文,研究通过筛选了一系列番茄突变体鉴定到与Pep MV易感性降低相关的关键突变,并成功定位到一个新的易感因子SlOSCA4.1,这一研究不仅有助于培育抗PepMV的番茄品种,而且有助于更好地理解病毒生物学和病毒—宿主分子相互作用。

利用DAS-ELISA进行番茄花叶病毒的田间检测

从制备的番茄花叶病毒（ＴｏＭＶ－ Ｓ１） 抗血清中提纯ＩｇＧ，并用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶（ＨＲＰ） 标记，建立了检测ＴｏＭＶ 的ＤＡＳ－ ＥＬＩＳＡ 系统。利用此检测系统并结合生物学方法，对浙江及山西等地的田间病样进行测定，结果发现茄子、番茄等茄科作物中均有ＴｏＭＶ 的侵染，其中茄子中有５０ ％ 左右的发生率，番茄中ＴｏＭＶ 发生率南北差异较大， 在浙江发生率仅为１０ ％ 左右，而在山西有６０ ．７ ％ 的发生率，辣椒中未测到ＴｏＭＶ。这是在我国首次进行ＴｏＭＶ

番茄花叶病毒移动蛋白和番茄抗病基因Tm-2^2的互作诱导烟草转化体程序性细胞死亡

番茄的抗病基因Tm -2 2 与番茄花叶病毒 (ToMV)的移动蛋白MP基因是一对互作的基因 ,Tm- 2 2 基因和ToMV MP基因同时在烟草中表达 ,并分别获得单一基因整合的纯合转化体植株。病毒接种试验表明 ,Tm -2 2 基因转化体与Tm- 2 2 番茄对Tobamavirus病毒的特异抗性结果一致 ;Tm -2 2 转基因植株和ToMV MP转基因植株杂交试验及其农杆菌注射试验均证明 :(1)Tm -2 2 基因与ToMV- MP在转基因烟草上保持“基因对基因”的互作关系 ;(2 )在外源乙烯的参与下 ,ToMV的移动蛋白与Tm -2 2 基因编码蛋白的互作能够诱导转化体程序性细胞死亡。这一结果为今后研究Tm -2 2 与MP互作的分子机制奠定了基础。

番茄花叶病毒番茄分离物与烟草花叶病毒蚕豆分离物生物学、血清学比较及PCR特异性检测

对番茄花叶病毒番茄分离物（ＴｏＭＶ－Ｔｏ－Ｓ１）和烟草花叶病毒蚕豆分离物（ＴＭＶ－Ｂ９３５Ａ）进行了生物学和血清学比较。人工接种６科２０种植物，这两个分离物均能侵染其中的３科１４种植物，但在普通烟（白肋烟、黄苗榆）上的症状差异较大，前者在这些植物上引起局部症状，后者为系统症状。在琼脂双扩散试验中，两者与ＴｏＭＶ－Ｔｏ－Ｓ１抗血清和４种ＴＭＶ抗血清均形成沉淀线，但沉淀线之间产生刺角，说明ＴｏＭＶ－Ｔｏ－Ｓ１和ＴＭＶ－Ｂ９３５Ａ虽有血清关系，但亦有差异。胶内交叉吸附试验也证明两者之间有血清学差异。根据已报道的ＴｏＭＶ－Ｌ株系和ＴＭＶＵ１株系ＣＰ基因的３′端非编码区序列设计了ＴｏＭＶ和ＴＭＶ特异引物，采用ＰＣＲ方法，这些引物能够特异性的检测区分ＴｏＭＶ－Ｔｏ－Ｓ１和ＴＭＶ－Ｂ９３５Ａ。

番茄抗番茄花叶病毒和斑点萎凋病毒病基因PCR标记的同时鉴定

利用同一PCR反应体系,对分别与番茄的抗番茄花叶病毒病的Tm22基因和抗斑点萎凋病毒病的Sw-5基因紧密连锁的SCAR标记进行了同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合,其中与Tm22基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感试材均产生800bp的特异片段,杂合抗病基因型和感病基因型有HindIII酶切位点,酶切结果为:纯合抗病RR:950bp;杂合抗病Rr:950bp+500bp+300bp+150bp;感病的rr:500bp+300bp+150bp,纯合抗病基因型无HindIII酶切位点。与Sw-5基因紧密连锁的SCAR2标记为显性标记,只有抗病试材扩增出400bp的特异性片段。经反复验证,结果稳定、准确可靠,可用于在同一PCR反应体系中对2个抗病基因进行同时筛选鉴定。该体系的建立不仅省时、省工、节省费用,而且可用于苗期早期辅助选育,加快番茄育种进程。

番茄花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用番茄花叶病毒 (ToMV)免疫的BALB c鼠脾细胞与SP2 0鼠骨髓瘤细胞融合 ,经筛选克隆 ,获得 4株能稳定传代并分泌抗ToMV单克隆抗体 (MAb)的杂交瘤细胞 ,其中 2株能同时检测ToMV和烟草花叶病毒 (TMV) ,各单克隆抗体腹水ELLSA效价在 1∶3 2 0 0 0～ 1∶1 0 2 4 0 0 0之间。经TAS ELISA测定 ,4株单克隆抗体检测病汁液的稀释度均能达到 1∶2 0 0 0倍以上。 4株单克隆抗体与其他病毒无交叉反应。Western blot分析表明 ,其中两株与ToMV1 7 6kD的外壳蛋白亚基有特异反应 ,而另两株无反应 ,推测它们是针对构象决定簇的抗体。

宁夏地区不同品种番茄主要病毒病的分子鉴定及抗性评价

为明确宁夏地区番茄上的病毒种类并分析复合侵染状况以及评价不同品种番茄的抗病性,于宁夏贺兰园艺产业园采集139份番茄疑似病毒样品(共22个品种),利用主要的8种番茄病毒特异性引物对病样进行RT-PCR分子检测与鉴定。结果显示:在疑似病样中,病毒检出率为98.56%,其中,ToMMV首次在银川市检出,检出率显著高于其他病毒,达92.05%,为当地优势毒源;其次为TSWV和STV检出率分别为76.04%和73.35%;TYLCV、ToCV、ToMV、CMV和TMV检出率较低。通过对番茄病毒的复合侵染现象分析发现,复合侵染的样本占阳性样本数的94.89%,其中3种病毒的复合侵染率占复合侵染总比的53.08%,且3种和4种复合侵染类型繁多。此外,对22个品种感病情况分析,‘冠蔬106’感染的病毒种类最多,为6种,而‘黑小哥’未检测出以上8种番茄病毒。进而对番茄病毒病抗性品种进行初步评估,‘黑小哥’‘千禧’‘香妃9号’‘152’‘冠疏103’‘193’和‘赛硒柿2号’这7个品种为抗病毒品种。综上,面对外来病毒的侵入,复合侵染的暴发,应当引起高度重视和警惕。

表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄抗黄瓜花叶病毒侵染

通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)的cDNA成功地引入番茄(Lycopersicon esculentum)植株中,并得到转基因植株。用强致病力CMV株系接种后,表达CMV外壳蛋白的转基因植株表现出对CMV侵染的抗性。转基因植株RI代的抗性基因以接近3:1比例分离。对R_1代接种CMV后,表达CMV CP的植株病症减轻,发病率、病情指数及病毒积累量明显低于对照。病症出现推迟1个多月。

新疆加工番茄上番茄花叶病毒的分子鉴定

从表现花叶、畸形的加工番茄病株上获得分离物xj124，用1对ToMVCP基因引物进行RT-PCR，扩增得到了689bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物插入到克隆载体pMD18-T中再转化到大肠杆菌TOP10。经限制酶酶切鉴定，重组克隆中含有与PCR产物大小相同的689bp的插入片段。cDNA全序列分析表明，所扩增出的689bpToMVCP基因，含1个480bp开放阅读框架（ORV），编码160氨基酸组成的蛋白，所克隆的基因包含完整的ToMVCP基因。所测得的xj124分离物与国内外已报道的部分ToMV CP基因序列比较。核苷酸同源性高达84．4％-99．8％，氨基酸同源性高达98．7％-100％。因此将该分离物鉴定为番茄病毒病花叶病毒。

侵染番茄的番茄花叶病毒的研究

从种传番茄苗中获得一病毒分离物Ｔｏ－Ｓｌ，人工摩擦接种７科２４种植物，Ｔｏ～Ｓｌ能侵染４科１５种植物，在番茄上产生花叶，在白肋烟上为局部枯斑。Ｔｏ－Ｓｌ的钝化温度为８５～９０℃，稀释限点为１０￣（－６）～１０￣（－７）．体外保毒期在一个月以上。病毒粒体杆状，长度主要分布于２８１～３００ｎｍ之间，平均长度２８８ｎｍ。病毒衣壳蛋白亚基只有一条多肽链，分子量为２１ｋＤａ。ｄｓＲＮＡ分析测得其基因组长度为６．４ｋｂ。琼胎糖双扩散和胶内交叉吸附试验证明，Ｔｏ－Ｓｌ与ＴＭＶ有血清关系，但有一定的差异，病毒粒体电泳分析也表明Ｔｏ－Ｓｌ与ＴＭＶ粒体有差异。在交叉保护试验中，ＴＭＶ和Ｔｏ－Ｓｌ之间均无保护作用。根据以上试验结果Ｔｏ－Ｓｌ被鉴定为番茄花叶病毒。这是我国首次系统报道番茄上番茄花叶病毒的侵染。

受番茄花叶病毒侵染后寄主的超微病变研究

电镜观察了番茄花叶病毒 (ToMV)侵染不同寄主的细胞超微结构变化。在 2 5℃下ToMV侵染番茄(LycopersiconesculentumMill.)后 ,病毒粒子在叶片的表皮、薄壁细胞、维管束组织的细胞质中形成大块结晶体和类结晶体 ,液泡膜处产生小泡结构 ,有多泡体和髓鞘样结构伸入液泡中。在 2 5℃下ToMV侵染珊西烟(NicotianatabacumL .cv .Xanthinn)后 ,除存在病毒结晶体和类结晶体外 ,还形成角层状聚集体 ,叶绿体产生周边囊泡结构。在 35℃下ToMV侵染珊西烟后 ,在细胞质中还形成高电子密度的无定型体。两种寄主中均未观察到X体 ,细胞核和叶绿体中无病毒粒子。结果表明ToMV的细胞病变特征与烟草花叶病毒 (TMV)存在差异 ,可作为病毒诊断的依据之一。

进境番茄种子中番茄花叶病毒的检测与鉴定

利用双抗夹心-酶联免疫吸附试验（DAF〉EI。ISA）和反转录-聚合酶链式反应（Rrr_PCR）方法对来自韩国的番茄种子进行种传病毒检测。结果表明，在该批番茄种子中检测到番茄花叶病毒（ToMV）和烟草花叶病毒（TMV）。PCR产物测序结果表明，ToMV特异引物（ToA／ToB）与TMV特异引物（TA／TB）扩增的片段均为ToMV的外壳蛋白（CP）基因及3’非编码区（3’-UTR），该片段与其他ToMV分离物的核苷酸序列相似性为98．2％～99．9％。本研究利用重新设计合成TMV和ToMV特异引物对该批种子进行RT-PCR检测，仅ToMV特异性引物（ToMfl／ToMrl）扩增到670bp的预期片段，TMV特异引物（TMfl／TMrl）则未出现特异性扩增，表明重新设计的引物可准确区分ToMV和TMV。以上结果证实该批番茄种子仅携带ToMV。