转番茄Tm-2^2基因烟草T2代植株的生物学性状变异

Tm-22基因转化烟草并获得表达,表明Tm-22基因的功能在同科不同属的植物体上没有改变.但是转基因烟草的T2代出现了许多生物学性状的变异,例如,无花粉花药、花瓣呈浅色、植株体矮化、种苗黄化等,这种变异性状的产生不仅有外源基因重组的因素,也是该基因与其它基因相互作用的结果.这些变异的个体为研究该基因的功能及其遗传变异规律提供了丰富的材料.

番茄Tm-2^2基因在烟草中的表达及其对番茄花叶病毒（TOMV）的特异抗性

Tm-22基因在烟草上的转化和表达表明,Tm-22基因在同科不同属植物体上的功能没有改变。在两种类型的纯合转化体上,Tm-22基因编码蛋白能够抗Tobamovirus属5种不同的毒株,并能被ToMV-2a毒株感染而失去抗病性。这个结果表明:移动蛋白上的氨基酸变异能够影响R蛋白对ToMV的应答反应。Tm-22基因转化体在不同启动子的调控下,对ToMV-2a毒株感染所表现的症状不同,说明启动子在Tm-22基因的抗病反应中具有非常重要的作用。

番茄花叶病毒移动蛋白和番茄抗病基因Tm-2^2的互作诱导烟草转化体程序性细胞死亡

番茄的抗病基因Tm -2 2 与番茄花叶病毒 (ToMV)的移动蛋白MP基因是一对互作的基因 ,Tm- 2 2 基因和ToMV MP基因同时在烟草中表达 ,并分别获得单一基因整合的纯合转化体植株。病毒接种试验表明 ,Tm -2 2 基因转化体与Tm- 2 2 番茄对Tobamavirus病毒的特异抗性结果一致 ;Tm -2 2 转基因植株和ToMV MP转基因植株杂交试验及其农杆菌注射试验均证明 :(1)Tm -2 2 基因与ToMV- MP在转基因烟草上保持“基因对基因”的互作关系 ;(2 )在外源乙烯的参与下 ,ToMV的移动蛋白与Tm -2 2 基因编码蛋白的互作能够诱导转化体程序性细胞死亡。这一结果为今后研究Tm -2 2 与MP互作的分子机制奠定了基础。

番茄Manapal Tm-2^(nv)中的抗性基因对TMV的抗性遗传研究

对Manapal Tm-2^(nv)及其子代的水平方向试材——转育材料和杂一代与垂直方向试材——自交和回交后代,在苗期接种TMV1株系的结果为:转育材料与Manapal Tm-2^(nv)抗性水平一致(HR);F_1均有不同程度感病,抗性水平下降(R);自交和回交后代的发病牢和病情指数与幼苗群体中所含的R(抗性因子)值呈负相关。认为Tm-2^(nv)基因对TMV的抗性遗传是独立而稳定的,且在F_1中表现为不完全显性;F_1抗病程度关键在于作抗病亲本的选择。

番茄抗病基因Tm-2^2及其等位基因氨基酸序列的比较

从4个番茄栽培品种（Lycopersicon esculentum Miller）中获得了Tm-2^2等位基因的同源克隆，进行序列分析，结果表明：‘沙龙’、‘渝抗2号’和‘97-4’分别与‘GCR-267’（Tm-2^2）、‘GCR-236’（Tm-2）、以及‘GCR-26’（tm-2）有100％的同源性，而樱桃番茄（Lycopersicon peruvianum．var．cerasiforme）品种‘樱红1号’与‘GCR-26’（tm-2）仅有98％的同源性；在C-端的LRR结构域中，抗病基因Tm-2。和Tm-2编码蛋白的氨基酸序列与感病基因tm-2存在624和704两个位点的氨基酸差异，即624位点的脯氨酸（P）对应亮氨酸（L）、704位点的甲硫氨酸（M）对应异亮氨酸（I）；在601—790个氨基酸的LRR结构域中，抗病基因Tm-2、Tm-2及其秘鲁种（Lycopersicon peruvianum var．dentatum）lptm-2三者均与感病基因tm-2的编码蛋白存在23个氨基酸的差异；樱桃番茄品种‘樱红1号’与含有tm-2基因的栽培种之间具有同源性关系。

α2珠蛋白基因Questembert变异联合-α^(3.7)缺失导致α-地中海贫血一家系的遗传学研究

目的 对1例疑似α-地中海贫血患儿及其家系进行遗传学病因分析,了解基因型-表型关系,并进行产前诊断。方法 该疑似α-地中海贫血患儿(先证者)于2021年5月20日至湖州市妇幼保健院遗传咨询科就诊。收集该患儿及其家系成员的贫血相关资料,对先证者及其家系采用荧光定量PCR法对常见α-地中海贫血基因检测后,再进行先证者的血液系统疾病Panel二代测序,并利用Sanger测序法进行变异验证以及其家系成员和母亲羊水DNA的变异验证。结果 PCR法检出患儿-α^(3.7)缺失型变异,缺失来源于父亲;二代测序检测出先证者患有α2珠蛋白基因HbA2 c.394T>C(p.Ser132Pro)纯合变异,母亲和其家系检出多名该位点的杂合性变异,而母亲羊水DNA未检测到上述异常。结论 相较于αα/-α^(3.7)缺失,HbA2 c.394T>C杂合性非缺失型变异家系表现出更典型的α-地中海贫血特征。而HbA2基因的c.394T>C又称为Hb Questembert变异,为可疑致病性变异,丰富了中国人的α-地中海贫血致病基因变异谱,为该家系疾病的诊断、治疗和遗传咨询提供了依据。

朝天椒Tm-2^(nv)-Like基因的同源克隆及其表达验证

番茄的Tm-2nv基因是一个NBS-LRR类型的病毒抗性基因。本研究以该基因的保守序列作为扩增引物,对辣椒栽培种朝天椒的基因组DNA进行电子分析、同源扩增和表达验证,首次获得了具有70%相似性的同源基因。生物信息学分析显示,朝天椒Tm-2nv-like基因的N端289～300 nt处和316～333 nt处分别含有12和18个碱基的插入,并且含有一个ATP/GTP结合位点的基序A(P-loop),以及3个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点。这一结果对于辣椒抗病基因功能的研究具有重要意义。

由基因序列开发番茄枯萎病抗性基因I-2的共显性分子标记

根据I-2的基因序列设计特异扩增引物对I-2/5F和I-2/5R,扩增I-2基因3132～3765bp之间片段,基因型为I-2/I-2的材料03F-7可扩增出633bp的条带,而基因型为i-2/i-2的材料Moneymaker可扩增出693bp的条带,杂合型材料可扩增出以上2个条带。通过这两个特异扩增片段的克隆和测序证明,抗病材料扩增的633bp片段为I-2基因的3132～3765bp之间的序列,而感病等位基因中出现大量的碱基突变和60bp片段插入。利用引物对I-2/5F和I-2/5R,可区分纯合抗病材料、杂合抗病材料和纯合感病材料,从而建立了I-2基因的共显性分子标记。在此基础上,利用该标记对16个主要番茄品种进行基因型鉴定,8个品种含有I-2基因,其中1个品种基因型为I-2/I-2,其他品种为I-2/i-2。通过一次PCR和一次HindⅢ酶切建立了I-2和Tm-22双基因检测体系,为多基因鉴定及标记辅助选择提供了有力工具。

番茄枯萎病抗性基因I-2的显性分子标记及其应用

番茄是世界上最主要的蔬菜作物之一，番茄枯萎病（Fusarium oxysporumf．sp．lycopersici）的发生和蔓延使番茄生产受到严重影响，培育抗枯萎病的番茄品种是控制该病害最经济有效的方法。本研究根据I-2的基因序列设计特异扩增引物，以不同抗病基因型的番茄为材料，扩增I-2基因3132～3640bp之间的单拷贝片段，基因型为，I-2／-的材料均特异地扩增出一条509bp的条带，而基因型为i-2/i-2的材料均无扩增条带。从而可建立了I-2基因的显性标记，对I-2基因进行分子识别。在此基础上，利用该标记对16个主要番茄品种进行了I-2基因鉴定，其中8个品种含有I-2基因。另外，本研究通过一次PCR和一次HindⅢ酶切建立了，-2和Tm-2^2双基因检测体系，为多基因鉴定及标记辅助选择提供了有力工具。

花青素调节基因VlmybA2对番茄遗传转化

以小型番茄 Micro-Tom 为材料,利用农杆菌介导法导入花青素调节基因VlmybA2。对抗性筛选出的再生植株进行 GUS 组织染色和 PCR 检测,证明外源基因已经整合到 Micro-Tom 中,转基因番茄根、茎、叶脉、果皮均呈紫色,花色为黄紫嵌合。而野生型的根为白色,茎、叶脉呈绿色,果皮为红色,花为黄色。对转基因番茄的花青素含量、叶片叶绿素含量和光合速率等生理指标进行测定,花青素含量有显著增加,叶绿素含量降低,VlmybA2基因过量表达会降低植株的光合效率,但对植株正常生长影响并不显著。VlmybA2 基因既可增加抗衰老物质花青素含量,又可作为转基因植株的报告基因。

FANCD2在子宫内膜癌中的表达及其意义

目的:分析范可尼贫血相关基因D2(FANCD2)在子宫内膜癌(UCEC)的表达及其意义。方法:生物信息学分析FANCD2在UCEC中的表达、预后及与免疫细胞浸润的关系;逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测FANCD2在62例子宫内膜癌和28例正常子宫内膜组织中的表达,分析其表达与临床病理特征的关系;敲减(KD)技术构建低表达的FANCD2载体,与空白载体一同转染Ishikawa细胞,检测不同浓度顺铂处理后Ishikawa细胞、Ishikawa-Vector、Ishikawa-FANCD2KD内谷胱甘肽(GSH)和脂质氧化(MDA)水平。结果:生物信息学分析显示,FANCD2在UCEC组织中高表达(P<0.05),且高表达的患者有较差的预后(P<0.05);免疫浸润分析显示,常见免疫细胞(B细胞、CD8^(+)T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)的浸润与FANCD2负相关(P<0.05);与Ishikawa-Vector相比,经不同浓度顺铂处理后的Ishikawa-FANCD2KD中GSH水平降低(P<0.05);MDA水平增高(P<0.05)。结论:FANCD2在UCEC中高表达,FANCD2下调可能通过铁死亡增加Ishikawa细胞对顺铂的敏感性。

广东番茄黄化曲叶病毒AC2基因的原核表达及抗血清制备

利用PCR方法从广东番茄黄化曲叶病毒分离物G3(Tomato yellow leaf curl Guang dong virus-[G3],TYLCGuV-[G3])全长序列的重组质粒上扩增该病毒的AC2基因,将其构建至原核表达载体pET-28b(+)上,经IPTG诱导,在大肠埃希菌Rosetta(DE3)Ⅲ中高效表达.SDS-PAGE电泳结果显示,目的融合蛋白与预期大小一致,相对分子质量约为19 500.以诱导的融合蛋白为抗原,免疫注射新西兰大耳白兔制备抗血清,间接ELISA测定抗血清效价为1∶16 384.Western-blotting检测结果表明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应,为专化性抗血清.

影响农杆菌介导白细胞介素-2基因转化番茄的因素研究

利用农杆菌介导法将白细胞介素-2基因(il-2)导入番茄中,对影响其转化的因素进行了分析。结果表明:农杆菌菌种(EHA105和C58C1)、外植体类型(子叶和下胚轴)、带有不同筛选标记(Kanr、PPTr、Hygr)的载体质粒几个因素对芽诱导分化及转化均有影响。实验共接种转化2018个子叶和下胚轴外植体,获得了47株抗性再生株,对其进行il-2的PCR扩增检测,有44株呈阳性。PCR-Southern杂交证实PCR结果可靠,显示il-2基因已导入到番茄中。

抗番茄黄化曲叶病基因Ty-2的SSR新标记

采用集合分离分析法(Bulked segregant analysis,BSA),结合SSR分子标记技术筛选与抗病基因Ty-2连锁的标记。将感病材料TMXA48-4-0与含有Ty-2的抗病材料CLN2777A杂交,获得F2分离群体。利用前人初步定位的结果及构建的番茄SSR遗传图谱,选择11号染色体上TG36与TG393标记之间的SSR标记对构建的抗感池进行筛选分析,结果得到1个与Ty-2紧密连锁的呈共显性的分子标记TES0344,遗传距离为6.7 cM。利用F2分离群体和10份同源材料进一步验证了SSR标记TES0344的可靠性和稳定性,因此该标记可用于今后抗番茄黄化曲叶病毒病育种的辅助选择。

农杆菌介导的反义LeERF2基因转化番茄

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法将LeERF2反义基因导入中蔬四号番茄(Lycopersicon esculentumcv.No.4 Zhongshu)进行遗传转化研究。在卡那霉素选择压力下获得的再生植株,经过PCR、点杂交和Southern杂交鉴定,证实了该反义基因已导入番茄基因组中,共获得了25棵转基因植株,并建立了一个高效的番茄转化体系。Northern杂交结果表明,转反义LeERF2基因番茄果实外果皮LeERF2基因表达水平比野生型番茄低。

番茄EBF2基因的克隆、亚细胞定位与遗传转化

为研究番茄EBF2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增了全长EBF2基因,将其与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合表达载体,在烟草原生质体中进行瞬时表达。结果表明,该基因定位于细胞核内。将该基因定向克隆到植物表达载体pCambia1301,构建成由组成型启动子CaMV35S启动的植物表达载体pCambia1301-EBF2,通过农杆菌介导方法转化MicroTom番茄。经PCR及GUS组织染色检测,外源基因已整合到番茄基因组中。

转FRO2基因番茄突变体的抗缺铁黄化特性

为了增加植物的抗缺铁黄化能力，研究了转FRO2基因番茄突变体抗黄化特性．结果显示FRO2基因转化番茄后，使生长在缺铁胁迫下的植株根系铁还原酶活性大大增强（转FRO2基因番茄植株根系酶活性是对照2倍），番茄铁吸收能力和有效铁还原能力大大加强，植株中有效铁含量增加（转FRO2基因番茄植株叶片有效铁含量是时照的1．5倍），转FRO2基因番茄的植株叶片颜色显著比对照绿，黄化程度减轻，黄化指数降低（对照的黄化指数是转FRO2基因番茄的1．3倍），植株生长量显著高于对照（转基因植株株高高于对照50％）．在正常条件下，转FRO2基因番茄根系的FRO2基因表达量增加，铁还原酶活性增加了1．75倍，转FRO2基因番茄植株叶片有效铁含量是对照植株的2倍，是其他耐贮藏转基因番茄的（转反义NR、ACC、CTR1基因）2～3．5倍以上．

转CBF2基因番茄抗NaCl胁迫研究

为明确CBF2基因过量表达对提高植物抗盐胁迫的作用,对NaCl胁迫下的转基因番茄株系进行了分子检测和生理特性分析。结果表明CBF2基因过量表达能够提高转基因番茄植株的耐NaCl能力,表现为在含有150 mmol/L和300 mmol/L NaCl的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系,在生理生化特性上表现为转基因番茄的可溶性蛋白含量和过氧化物酶(POD)活性比非转基因株系明显增加,而丙二醛(MDA)含量明显低于非转基因株系。

^(125)I粒子植入辅助治疗晚期肝癌后IL-33、ST2、Th1/Th2相关细胞因子的变化

目的:探究^(125)I粒子植入辅助治疗晚期肝癌后白细胞介素-33(IL-33)、癌性抑制基因2(ST2)、辅助性T细胞1(Th1)/辅助性T细胞2(Th2)相关细胞因子的变化。方法:选取2019年7月至2021年4月收治的94例晚期肝癌患者作为研究对象,按照随机数字表法按1∶1比例分为观察组、对照组,各47例。对照组患者采用肝动脉化学治疗栓塞术(TACE)治疗,观察组患者在对照组治疗基础上加用^(125)I粒子植入辅助治疗。比较两组患者临床疗效,治疗前、治疗后2个月肿瘤标志物水平[糖类抗原19-9(CA19-9)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)]、生活质量核心量表(QLQ-C30)评分、Th1[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)]、Th2[白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)]相关细胞因子水平,血清IL-33、ST2水平及并发症发生率。结果:观察组患者疾病控制率74.47%高于对照组的51.06%(P<0.05);治疗后2个月,观察组患者血清CA19-9、AFP、CEA、AFU水平、QLQ-C30评分、IL-4、IL-6、IL-33、ST2水平;低于对照组(P<0.05);治疗后2个月观察组患者血清TNF-α、IFN-γ水平高于对照组,两组患者并发症发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:^(125)I粒子植入辅助治疗晚期肝癌患者效果显著,可调节血清IL-33、ST2水平,促使Th1/Th2平衡,降低肿瘤标志物水平,提高患者生活质量,且安全性较高。

SlMYC2转录因子对番茄伤害诱导抗性相关基因的调控研究

MYC2作为茉莉酸信号途径中一个重要的转录因子,在调控植物对昆虫取食和腐生型病原菌的抗性反应中发挥重要作用。但迄今为止,在番茄中仍未有关于SlMYC2突变体(或SlMYC2沉默转基因植物)的报道。在改造pCAMBIA1301表达载体的基础上,利用RNAi方法构建SlMYC2沉默的转基因植物。利用荧光定量PCR方法,证明这些转基因植物中SlMYC2表达量显著下降,达到沉默SlMYC2的目的。通过检测SlMYC2-RNAi转基因植物中伤害诱导标记基因的表达情况,发现SlMYC2-RNAi转基因植物中伤害诱导的早期响应基因和晚期响应基因的表达都受到明显抑制,结果表明SlMYC2转录因子在调控番茄伤害诱导相关抗性基因的表达中发挥重要作用。