番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗在番鸭体内中和抗体消长规律的研究

为明确番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗在番鸭体内中和抗体消长规律,采用固定病毒稀释血清法,测定了经弱毒疫苗免疫后的雏番鸭不同时间其血清中和抗体效价。结果显示:疫苗注射1日龄雏番鸭,免疫后28d部分鸭血清中出现抗体,35d全部鸭血清中出现抗体;6个月抗体效价达高峰,有效免疫期在18个月以上。表明番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗诱导的中和抗体产生期较晚,但持续期长。

新型鸭呼肠孤病毒弱毒S株在雏番鸭体内的增殖规律

【目的】研究新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)弱毒S株C30在雏番鸭血液中的病毒血症,口咽、泄殖腔的排毒规律及靶器官的带毒时间,了解弱毒S株在雏番鸭体内的增殖规律和致弱机理。【方法】设计特异性引物,建立检测NDRV核酸的RT-qPCR方法;新型鸭呼肠孤病毒弱毒S株第30代(NDRV-S-C30)腿部肌肉注射2日龄雏番鸭,在免疫后1、2、3、4、6、8、10、12、14 d(Days post vaccination,dpv)采集其血液、肝脏、脾脏、泄殖腔分泌液和口咽液,用RT-qPCR方法检测NDRV在血液、口咽、泄殖腔及靶器官的增殖能力及带毒时间。【结果】建立了检测NDRV核酸的特异性RT-qPCR方法,使用该方法检测NDRV弱毒攻毒雏鸭的口咽和泄殖腔排毒时间分别为2~8 d和2~10 d,排毒高峰期为4~6 d;病毒血症时间为1~4 d,其中1~2 d为病毒血症高峰期;弱毒在肝脏的带毒时间为3~6 d,在脾脏的带毒时间为1~8 d。【结论】NDRV-S-C30弱毒株免疫雏番鸭后可通过口腔和泄殖腔向外界排毒,仅能引起较弱的病毒血症反应,且在肝脏中的增殖能力弱,丧失了对易感靶器官造成病理损伤的能力。明确了NDRV弱毒S株的排毒规律及病毒血症时间,为建立弱毒免疫效力评价方法奠定了基础。

番鸭呼肠孤病毒感染对MPV-GPV弱毒疫苗抗体应答的影响

1日龄番鸭感染番鸭呼肠孤病毒(MDRV)后,应用LPAI方法检测MPV-GPV二联弱毒疫苗免疫后抗体变化规律,应用MTT法测定番鸭血液、脾脏和胸腺的B淋巴细胞增殖功能,探讨MDRV对B淋巴细胞功能的影响。结果显示番鸭感染MDRV后免疫MPV-GPV二联疫苗,IM 7 d时番鸭GPV-LPAI效价平均值1.5log2;随后缓慢上升,到IM 21-28 d时GPVLPAI效价平均值维持在约3log2。与单独免疫组相比,GPV-LPAI效价大大降低,不能提供有效保护。1日龄番鸭人工感染MDRV后,PI 7 d外周血T淋巴细胞增殖指数与对照组相比明显下降(P<0.05)。PI 14-28 d与对照组相比下降,差异极显著(P<0.01),表明MDRV感染抑制了B淋巴细胞增殖功能。结果表明,MDRV感染能抑制抗体应答和番鸭外周血和免疫器官中B细胞的增殖功能作用,造成B细胞功能抑制。

番鸭呼肠孤病毒弱毒株在免疫番鸭体内的分布及排毒规律

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)B37弱毒株经肌内免疫1日龄雏鸭,应用RT-PCR检测病毒核酸,以阐明病毒在体内分布及排毒规律。结果表明,B37株免疫雏鸭后4h,即可在血液、心、肝、脾组织中检出DRV RNA;接种后8h,血液、心、肝、脾、肺、肾、胰腺均可检测到DRV RNA;接种后3d,喉头和泄殖腔棉拭子可检出DRV RNA;接种后14d,喉头和泄殖腔棉拭子已不能检出DRV RNA;接种后28d,肺、肾和胰腺均已不能检出DRV RNA;接种后42d,血和心脏已不能检出DRV RNA;接种后49d,所有组织均已不能检出DRV RNA。因此,DRV弱毒在血液、心脏中分布时间为接种后4h～35d,在肝、脾组织中分布时间为4h～42d;肺、肾和胰腺的分布时间为8h～25d;向外界排毒时间为3～14d。

番鸭呼肠孤病毒弱毒株选育研究

应用番鸭胚成纤维细胞和鸡胚成纤维细胞（CEF）交替传代选育出适应CEF繁殖的番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗株。该弱毒株已失去对1日龄雏番鸭的致病性，对CEF的TCIDs。稳定在10^-5～10^-5.5；在雏番鸭体内连续盲传5代，未见毒力返强现象；1日龄雏番鸭免疫不同代次弱毒后7d攻击番鸭呼肠孤病毒强毒，保护率均在88％以上，且不同代次弱毒的外源病毒检验结果均为阴性。上述结果表明该弱毒株无外源病毒污染、安全性好、遗传性稳定、免疫原性强，可用于制备番鸭呼肠孤病毒病活疫苗。

番鸭呼肠孤病毒病蜂胶佐剂灭活疫苗的研制

番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒感染引起的一种番鸭病毒性传染病。自在我国发生以来,给番鸭养殖业造成了严重损失。为防制本病,我们用分离毒NH9908株作为种毒,研制成一种蜂胶佐剂灭活疫苗。试验表明该疫苗抗原性良好、使用安全和免疫保护效果确实。实验室试验结果表明,用本疫苗免疫7d、14d、49d后攻毒保护指数分别为77.8、100、100。中试试验结果表明,保护率达95%。

番鸭呼肠孤病毒病活疫苗诱导的免疫应答分析

本研究旨在评价番鸭呼肠孤病毒病活疫苗对番鸭免疫功能的影响,探讨番鸭呼肠孤病毒病活疫苗的免疫机理;1日龄番鸭免疫番鸭呼肠孤病毒病活疫苗,分别于免疫后7～35d观察番鸭生长发育,检测免疫番鸭血清中和抗体效价,外周血淋巴细胞、胸腺细胞和法氏囊细胞对ConA、LPS的反应,细胞毒T细胞(CTL)的细胞毒性作用。结果显示:免疫番鸭生长发育正常,免疫器官中胸腺明显增大;免疫后35d血清中和抗体才开始上升;外周血和胸腺淋巴细胞对ConA的增殖反应显著提高(P<0.05);而外周血和法氏囊淋巴细胞对LPS增殖反应无显著变化(P<0.05);外周血细胞毒性T细胞杀伤功能增强(P<0.05)。结果提示番鸭呼肠孤病毒病活疫苗免疫后主要刺激提高番鸭细胞免疫功能,提高机体抵抗番鸭呼肠孤病毒的能力。

番鸭呼肠孤病毒感染对禽流感疫苗免疫抗体应答的影响

1日龄番鸭感染番鸭呼肠孤病毒(MDRV)后,应用MTT法测定番鸭血液、脾脏和胸腺的B淋巴细胞增殖功能,应用血凝抑制方法检测禽流感疫苗免疫后抗体变化规律,探讨MDRV对B淋巴细胞功能的影响。结果显示:免疫组番鸭禽流感疫苗二免后H5和H9 AIV-HI抗体效价上升,二免后14 d HI效价最高,随后抗体效价维持在7.5 log2以上。MDRV组番鸭二免后抗体缓慢上升,二免后21 d HI效价最高,随后抗体效价维持在6.0 log2以下,HI效价与对照组差异极显著(P<0.05)。1日龄番鸭人工感染MDRV后,免疫后7 d外周血T淋巴细胞增殖指数与对照组相比明显下降(P<0.05)。免疫后14~28 d与对照组相比显著下降,差异极显著(P<0.01),表明MDRV感染抑制了B淋巴细胞增殖功能。以上结果表明MDRV感染能抑制抗体应答和番鸭外周血和免疫器官中B细胞的增殖功能作用,造成B细胞功能抑制。

新型鸭呼肠孤病毒弱毒株在雏番鸭体内的分布和排毒规律

为了解新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)弱毒株感染雏番鸭后在体内的分布和排毒规律,本研究采用传代致弱的NDRV JDm10-150毒株接种1 d龄雏番鸭,对接毒后6 h~35 d雏番鸭的血液、脑、胸腺、心、肝、脾、肺、肾、胰腺、法氏囊、盲肠扁桃体、咽拭子和泄殖腔拭子采用qRT-PCR方法检测病毒分布情况。结果显示:接6 h后,在各组织脏器及血清中可检到NDRV核酸,且肝和脾病毒含量最高。随后,各组织脏器及血清中NDRV核酸含量逐渐减少。接毒后9 d,各组织器官及血液均检测不到NDRV核酸或NDRV核酸检测为阴性(Ct>35)。接毒后第13~35 d,除脑和血清外,大部分的组织脏器中均又检测到NDRV核酸,且NDRV核酸含量基本稳定,其中脾脏和法氏囊组织中NDRV核酸含量始终保持较高水平。对不同时间采集的咽拭子和泄殖腔拭子进行检测,发现雏番鸭在接毒后6 h开始向外界排毒,之后通过泄殖腔排毒,直至攻毒后28 d停止排毒。以上检测结果表明,NDRV JDm10弱毒株感染雏番鸭后快速侵入各组织脏器和血液,脾脏和法氏囊为主要侵染和定殖场所,主要通过泄殖腔分泌物向外界排毒。

首个预防“番鸭呼肠孤病毒病”活疫苗在福建面世

2013年11月25日，由福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒研究室承担的“番鸭呼肠孤病毒病活疫苗”获得农业部颁发的国家一类新兽药证书（2013新兽药证字41号）。这是我国具有自主知识产权的唯一用于预防番鸭呼肠孤病毒病的生物制品，也是世界上首个用于预防该病的疫苗。

禽呼肠孤病毒强毒株和弱毒疫苗株感染Vero细胞的蛋白质组学研究

为研究在禽呼肠孤病毒(ARV)不同毒力毒株感染后不同时间点宿主细胞中蛋白质组变化,运用双向凝胶电泳技术和质谱鉴定的蛋白质组学方法,对ARV强毒株S1133、弱毒疫苗株aS1133感染Vero细胞和对照细胞在不同时间点的蛋白质样品进行检测。鉴定结果表明,共鉴定出44个差异表达蛋白质,这些蛋白质包括α-烯醇化酶(α-enolase)、过氧化物酶(Prx-4)、hnRNPs、微管蛋白(Tubulin)、蛋白磷酸酶、转录延伸因子等。GO软件分析显示这些差异蛋白质主要参与细胞信号、细胞骨架组成、能量代谢、核酸代谢、蛋白质折叠、细胞增殖及凋亡等生物学功能。荧光定量RT-PCR验证表明,hnRNP和Prx-4在S1133感染细胞中表达水平持续上调,而Tubulin和α-enolase仅分别在48和24h时表达上调,与双向凝胶电泳的结果一致。以上试验数据揭示了ARV不同毒力毒株感染后细胞中蛋白质表达的差异变化,有助于进一步阐明ARV和宿主之间的相互作用。

禽呼肠孤病毒强毒株和弱毒疫苗株感染鸡肝癌细胞的转录组学分析

本研究旨在研究禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)强毒株S1133和弱毒疫苗株aS1133分别感染鸡肝癌(LMH)细胞后,LMH细胞基因组的转录水平变化。将1 MOI的ARV强毒株S1133和弱毒疫苗株aS1133分别感染LMH细胞,感染后6、12和24h,收集感染细胞和阴性对照细胞,制备总RNA样品,使用Illumina HiSeq^(TM)2000测序仪进行转录组学测序。以感染组之间样品中上下调转录差异≥2且P≤0.001的基因为差异基因,进行生物信息学分析并进行荧光定量PCR验证。分析结果表明,与ARV aS1133感染组相比,S1133感染组共有4 013个差异表达基因,其中6hpi时,58个上调表达差异基因,5个下调基因;12hpi时,1 429个上调基因,354个下调基因;24hpi时,1 680个上调基因,481个下调基因。K-平均值聚类分析结果说明这些差异基因的表达模式主要呈上调表达模式,并且有10种共表达趋势。GO功能注释和分析结果表明差异基因主要具有GTP酶调节活性、信号转导活性、蛋白激酶活性等生物功能;主要参与机体应激、细胞信号转导、细胞凋亡等生物过程。Pathway富集分析结果表明差异表达基因主要参与Toll样受体信号通路、TGF-β信号通路、病原体感染应答等细胞信号通路。随机选择部分差异表达基因进行荧光定量RT-PCR验证,其结果表明与转录组学测序结果基本一致。以上数据比较分析了ARV强毒株和弱毒疫苗株感染后LMH细胞的基因表达的变化差异,探讨了宿主细胞对ARV不同毒力毒株的可能不同应答机制,有利于进一步阐明ARV致病机制。

中国禽呼肠孤病毒番鸭分离株的纯化及其核酸与结构蛋白分析

将番鸭呼肠孤病毒国内分离株在番鸭成纤维细胞 (DEF)上克隆纯化 3次后 ,在鸡成纤维细胞 (CEF)上增殖 ,收获的细胞培养物经 3次冻融 ,采取差速离心、超速离心、非线性蔗糖密度梯度离心和脱糖处理相结合的方法进行提纯 ;对不同梯度区带的蛋白提取物经电镜观察、毒价(TCID50 )和含毒量测定得到病毒纯化物 ;最后对病毒纯化物进行琼脂糖核酸电泳和SDS PAGE蛋白电泳分析。结果 ,核酸电泳得到 10条RNA带 ,分列呈“334”形式的 3组 ,其迁移率除M 3基因外无明显差异 ;蛋白电泳得到分子质量分别为 14 9.0、12 9.0、111.0、79.0、75 .0、5 0 .0、4 2 .0、39.0、37.0、35 .9、32 .0、2 9.0ku的 12条蛋白带 ,其中 5个蛋白的分子质量与参考株S1133相近。该分离株具有禽类呼肠孤病毒核酸和蛋白电泳图谱的共同特征。

番鸭呼肠孤病毒在番鸭体内的动态分布和排毒规律

应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒在人工感染番鸭体内的动态分布和排毒规律。结果显示在感染后1 d可在肝、脾脏、法氏囊、胸腺和盲肠扁桃体中检出病毒RNA,表明病毒首先入侵免疫器官;随后其他器官中逐渐检测到病毒。高峰期为攻毒后7～14 d,所有器官中均能检测到病毒,此时也是病毒感染发病最严重的时间。感染后14 d,在肺和脑中不能检测到病毒;感染后25 d在肾和胰腺中不能检测到病毒;感染后28 d心和盲肠扁桃体中不能检测到病毒;感染后32 d所有器官中均不能检测到病毒。攻毒5 d后,即可在喉头和泄殖腔棉拭子中检测到DRV RNA,而在14 d后未能检出DRV RNA,表明番鸭接种强毒株后5 d开始向外界排毒,而14 d后停止向外界排毒。

番鸭呼肠孤病毒MW9710σC蛋白基因克隆及其在E.coli中表达

应用RT2PCR扩增出番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC基因,序列分析表明σC基因核苷酸数为810bp,编码269个氨基酸,相对分子量为29.4ku,DNAstar软件分析MW9710株的σC核苷酸序列和法国番鸭呼肠孤病毒89026株有93%的同源性,而与禽呼肠孤病毒的同源性仅在21%～25%之间,表明番鸭呼肠孤病毒是一类不同于禽呼肠孤病毒的新病毒。将σC基因片段亚克隆到原核表达载体pET32a中,经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,Western2blot进一步验证了表达产物与番鸭呼肠孤病毒阳性血清反应,表明σC基因表达产物具有免疫原性,为下一步研制番鸭呼肠孤病毒诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。

呼肠孤病毒弱毒S1133株特性研究

呼肠孤病毒S1133株细胞毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长良好,每0.1mL病毒液可达106.5～107.5TCID50。以104.5TCID50/只接种3周龄SPF雏鸡无致病性。免疫雏鸡可抵抗强毒足垫攻击,未免疫对照鸡则不能抗强毒攻击。表明该毒株安全且具有良好的免疫原性。

番鸭呼肠孤病毒病活疫苗可提高细胞免疫功能

福建省农业科学院畜牧兽医研究所林锋强等评价了番鸭呼肠孤病毒病活疫苗对番鸭免疫功能的影响，探讨番鸭呼肠孤病毒病活疫苗的免疫机理。1日龄番鸭免疫番鸭呼肠孤病毒病活疫苗，