半番鸭源禽1型副粘病毒FM01株的分离鉴定与F蛋白基因分析

从表现类似新城疫症状的病死半番鸭中分离到1株病毒FM01株,经血凝及血凝抑制试验证实为禽1型副粘病毒。以SPF鸡胚测定其平均致死时间为113.4h,对1d雏鸡脑内接种致病指数为0.23,表明为温和型毒株。利用RT-PCR技术一次性扩增其F蛋白全基因,克隆到pMD18-T质粒载体,测序后获得F基因全序列,并推导出其相应的氨基酸序列。FM01株的F蛋白基因完整的编码区全长1662bp,编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,具有温和型毒株特有的氨基酸序列结构。与常见新城疫毒株的核苷酸同源性在88.4%～99.6%之间,氨基酸同源性在89.2%～99.1%之间。

番鸭源小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的结构蛋白及其抗原性

应用交叉免疫印迹方法,分析比较了番鸭源小鹅瘟病毒(MDGPV)和番鸭细小病毒(MDPV)结构蛋白抗原性的差异.结果表明:MDGPV和MDPV纯化病毒在SDS-PAGE分析中均呈现3种结构蛋白,分子质量分别为81、65和55 ku;在免疫印迹试验中,MDGPV和MDPV的VP1、VP2和VP3三种结构蛋白均可被同源抗血清识别,而异源抗血清均不能识别VP1蛋白;免疫番鸭血清和感染耐过番鸭血清识别的条带无明显区别.可见,MDGPV和MDPV的抗原性差异主要体现在VP1蛋白上.

番鸭源基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性和免疫原性评价

为了解我国近年水禽主要流行的基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性和免疫原性,通过攻毒试验和免疫保护试验测定了1株本实验室分离保存的番鸭源基因Ⅶ型新城疫病毒MDK/FS-SS/E/2007的致病指数、雏番鸭致病性和免疫保护性等特征。致病指数评价结果显示,该毒株符合新城疫病毒强毒株标准。雏鸭致病试验结果显示,攻毒组动物均出现沉郁、瘫痪和扭颈等神经症状,剖检可见脑部充血、出血,胰腺、脾脏和肝脏等器官出现变性坏死等典型新城疫临床特征。免疫保护试验结果显示,以该毒株制备的油乳灭活疫苗对雏番鸭进行3次免疫,免疫后42 d血清HI抗体几何平均滴度水平可达1∶238.9,能为番鸭提供有效保护。研究结果为水禽新城疫诊断与免疫防控研究提供了参考资料。

FP1株番鸭源禽Ⅰ型副粘病毒抗原性分析

为明确FP1株番鸭源禽I型副粘病毒强毒与鸡新城疫强毒标准株F48E9之间的抗原性差异,本研究通过交互血凝抑制试验、血清交叉中和试验及雏番鸭免疫攻毒保护试验比较了FP1株番鸭源禽I型副粘病毒强毒与鸡新城疫强毒标准株F48E9之间的抗原性。结果显示同源阳性血清对病毒的血凝抑制效价比异源阳性血清对病毒的血凝抑制效价高2.66～4个滴度;两者之间的抗原相关值R为0.35;对于5日龄经肌注途径免疫接种1羽份量La Sota弱毒疫苗14 d后的雏番鸭,以FP1株番鸭源禽1型副粘病毒强毒、鸡新城疫强毒标准株F48E9分别攻击后,其保护指数分别为54.5、92.9。以上结果表明,FP1株番鸭源禽1型副粘病毒与鸡新城疫强毒标准株F48E9存在较明显的抗原性差异,为鸭副粘病毒病疫苗的研制和该病的防控提供了依据。

番鸭源禽1型副黏病毒HN基因主要抗原结构域和V基因融合表达载体的构建

为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA。将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定。利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定。对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体pcDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V。

半番鸭源鸭1型甲肝病毒亚型的分离鉴定及其VP1基因分析

自胰腺泛黄的雏半番鸭中分离获得1株病毒(命名为FJ1605株),经RT-PCR检测为鸭1型甲肝病毒,通过鸭胚中和试验发现该株病毒可被鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)高免血清特异性中和,确定该株病毒为鸭1型甲肝病毒亚型。对该株病毒VP1基因进行分子特征分析,发现其核苷酸大小为714bp,与GenBank登录的DHAV-1a同源性为98.1%~99.7%,与DHAV-1FJ1220毒株同源性最高达99.7%;而与鸭2型甲肝病毒(DHAV-2)、鸭3型甲肝病毒(DHAV-3)VP1基因的核苷酸同源性仅分别为65.7%和68.3%左右。基于VP1基因的遗传进化分析表明,FJ1605分离株属鸭1型甲肝病毒亚型谱系。以该株病毒对7日龄雏半番鸭进行人工感染试验,可完全复制出同于临床病例的病变。以上结果显示,雏半番鸭也可感染DHAV-1a,且表现为胰腺泛黄。

一株番鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为了对疑似禽霍乱病死番鸭进行病原诊断,为该病的诊断和防治提供参考依据,取病死番鸭的肝脏接种于血琼脂平板进行分离培养,挑取单个菌落染色镜检并进行生化试验,然后提取核酸,进行16S rRNA和荚膜血清型特异性基因的PCR扩增和测序分析。结果表明:从病死番鸭的肝脏中成功分离到一株革兰阴性且两极浓染的短杆菌,在血琼脂平板上长出灰白色、圆形、光滑、湿润、不透明的露滴样菌落;该菌分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖,只产酸不产气,不分解乳糖和鼠李糖,吲哚试验阳性,甲基红试验和V-P试验阴性;16S rRNA的测序结果经BLAST比对分析发现,其与多杀性巴氏杆菌同源性达100%,荚膜血清型的PCR鉴定结果为A型。说明病死番鸭为荚膜血清A型的多杀性巴氏杆菌感染。

福建省番鸭小鹅瘟流行毒株病原学研究

【目的】旨在研究福建省番鸭小鹅瘟病流行毒株及病毒遗传变异状况。【方法】从福建省番鸭主要饲养区收集临床疑似番鸭小鹅瘟病例30份,进行病原学检测、病原分离、病毒感染试验、基因片段序列分析。【结果】显示30份疑似病例中有15份为番鸭源鹅细小病毒(Muscovy duck-origin goose parvovirus,MDGPV)感染,占比50%。分离到的15株MDGPV均能致死番鸭胚,番鸭感染后发病率为60%~100%,死亡率为40%~60%。15株MDGPV分离毒VP 1基因核苷酸同源性在99.5%以上,与MDGPV-PT株同源性在96%以上,未发生碱基缺失、插入或基因重组,较为稳定;而与番鸭细小病毒MDPV-P株同源性小于90%。进化树分析显示15株分离毒与MDGPV-PT株属于同一分支,而与MDPV-P株属于不同分支。【结论】福建省2018年流行的MDGPV毒株与1997年分离的MDGPV-PT株致病性和基因序列特性相似,无明显变化,生物学特性和基因组特性比较稳定,遗传变异程度小。