原核表达dsRNA抗番木瓜畸形花叶病毒的研究

番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）是一种已对番木瓜种植业构成潜在威胁的新型病害,在转基因植物备受争议的背景下,利用原核表达的dsRNA来防控病毒的策略不失为一种新的选择.本文选取PLDMV CP基因全长（879 bp）,运用OZ-LIC法构建了含有pdk内含子的ihpRNA结构,将其嵌入原核表达载体pSP73中,并转化RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌M-Jm109LacY,构建了1种能高表达dsRNA的原核表达菌株M-Jm109LacY-CP879,以终浓度为0.4 mmol/LIPTG诱导后能够稳定高效的表达CP879-dsRNA.研究共设2个处理：保护性处理与治疗性处理.分别用含有CP879-dsRNA的粗提液对这2个处理的番木瓜植株进行喷施处理,通过统计发病率、观察病症变化以及ELISA分析结果表明,保护性处理能有效抑制番木瓜畸形花叶病毒的侵染,主要表现为发病时间推迟和相对较低的发病率;治疗性处理植株的病毒积累量会在喷施后第3～12天内出现暂时性的降低.结果表明,保护效果优于治疗效果,若每月喷施2～3次dsRNA粗提液,有望能够有效地预防PLDMV的侵染.

番木瓜畸形花叶病毒hc-pro基因保守基序FRNK点突变对病症表现的影响

为研究番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)hc-pro基因保守基序FRNK对病症表现的影响,本研究采用定点突变的方法,获得了PLDMV-DF的hc-pro基因保守基序FRNK的精氨酸(R)突变为异亮氨酸(I)的突变体克隆p35SPLDMV-GFP-R_(183)/I,该位点突变显著减轻了PLDMV在番木瓜上的病症表现,表明是影响其致病性的关键位点。本研究结果为利用交叉保护防控番木瓜畸形花叶病毒病提供了重要参考和材料。

番木瓜畸形花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析

从海南乐东的感病番木瓜叶片上提取总RNA,用RT-PCR方法扩增番木瓜环斑病毒(PRSV)外壳蛋白基因组序列。测序结果显示,该环斑病毒外壳蛋白基因扩增片段长867个核苷酸。相似性分析表明,该核苷酸序列与GenBank中报道的47株PRSV和1株畸形花叶病毒核苷酸序列的相似性在62.41%～94.71%之间。运用CLUSTALX和MEGA软件绘制系统进化树,结果表明,番木瓜PRSV病毒大致可分为美洲-澳洲类群和东亚-东南亚类群2大类,后者又可分为SB1、SB2、SB3等3个亚类。乐东毒株和已报到的畸形花叶病毒PaMLV病毒都属于PRSV。不过乐东毒株属于SB1亚类,而PaMLV属于SB2亚类。乐东毒株(JQ318029)和另一海南毒株(HQ424465)属于SB1亚簇,信心指数分别达到89%、83%、96%。不过乐东毒株与越南北部的4种毒株(AF506875、FN808408、AJ875115、U14742)的同源性更高,说明导致乐东畸形花叶病的毒株可能来自越南,而不是由海南本地毒株变异而来。

番木瓜感染畸形花叶病毒后的生理变化及扫描电镜观察

【目的】阐明番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)的侵染机理及侵染后番木瓜自身防御体系对抗病毒的作用机制,为番木瓜病毒病防治提供参考。【方法】以台农二号番木瓜为材料,通过RTPCR检测接种PLDMV处理组(T)与健康空白对照组(CK)的病毒感染情况,采用分光光度法测定PLDMV侵染对番木瓜相关生理指标的影响,运用扫描电镜法观察两组番木瓜叶片的微观结构差异。【结果】通过RT-PCR检测,证明T番木瓜植株已感染PLDMV。T与CK番木瓜叶片在表征、微观解剖结构及生理指标等方面均存在明显差异,与CK番木瓜叶片相比,T番木瓜叶片纵切面栅海比及背部绒毛密度明显小于CK番木瓜,气孔密度大于CK番木瓜;T番木瓜的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性和脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、超氧阴离子(O)含量均显著高于CK番木瓜(P<0.05,下同),过氧化氢酶(CAT)活性和叶绿素(Chl)含量显著低于CK番木瓜,而超氧化物歧化酶(SOD)和几丁质酶活性两组间无显著差异(P>0.05)。【结论】番木瓜受PLDMV侵染后,其叶片结构被破坏,细胞毒害损伤严重,体内代谢紊乱,多种代谢调节平衡被打破,番木瓜的正常生长发育受阻。

番木瓜畸形花叶病毒HC-Pro蛋白的原核表达与纯化

番木瓜畸形花叶病毒(papaya leaf distortion mosaic virus, PLDMV, Potyvirus属)是目前威胁中国番木瓜种植的主要病原之一。辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase, HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒运动、复制、媒介传播、基因沉默抑制的多功能蛋白。为了获得HC-Pro基因的纯化蛋白,本研究通过密码子优化HC-Pro基因序列,成功构建原核表达质粒p ET-30a-HCPro,经IPTG诱导后实现HC-Pro在大肠杆菌中的原核表达,在0.5 mmol/L IPTG,20℃条件下诱导过夜时其表达量最高;破碎菌体后,SDS分析全菌、破碎上清以及沉淀中目标蛋白的表达量,结果显示重组HC-Pro蛋白主要以不可溶的包涵体形式在沉淀中表达;进一步溶解包涵体通过Ni-NTA层析柱进行纯化,在500 mmol/L浓度咪唑下可以获得分子量大小约为54 kD的HC-Pro重组蛋白;Western Blot分析纯化后的目标蛋白,结果显示54 kD处有明显的条带,与预期的HC-Pro重组蛋白大小一致。本研究成功表达并纯化获得了PLDMV重组蛋白HC-Pro,为后续抗体制备和探究其功能提供了理论基础。

利用PLDMV/Twin-Strep侵染性克隆纯化HC-Pro病毒蛋白

番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)是一种新的潜在威胁番木瓜种植业的病毒,其辅助成分蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒复制、运动、寄主植物症状表现的多功能蛋白,因此纯化获得具有功能活性的HC-Pro蛋白,研究其多功能性具有重要意义。本研究利用In-Fusion拼接策略和E.coli Cell-Free快速构建植物病毒侵染性克隆法,一步快速地将28个氨基酸组成的蛋白标签Twin-Strep插入到PLDMV HC-Pro氨基端,成功获得了基于农杆菌的携带Twin-Strep标签的PLDMV侵染性克隆pPLDMV-Strep。通过农杆菌渗透注射接种番木瓜植株,从感染PLDMV-Strep的番木瓜叶片总蛋白中,利用Twin-Strep蛋白标签亲和层析分离纯化获得PLDMVHC-Pro蛋白,并通过LC/ESI-MS/MS(liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometric)对其进行蛋白N端和C端序列测序,证明了纯化获得完整的PLDMVHC-Pro蛋白。研究结果为后续解析PLDMV HC-Pro在病毒侵染过程中的功能及与寄主蛋白相互作用奠定了基础。

一种E.coli-Free的酵母同源重组系统稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的新方法

侵染性克隆是研究病毒的重要工具,而偏大的病毒基因组及其在大肠杆菌中的不稳定给构建侵染性克隆造成很大困难。通常采用插入内含子和酵母同源重组等方式可以获得稳定克隆,但本实验最初利用酵母同源重组系统并未成功构建番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)的侵染性克隆。经研究证实,该不稳定现象确实存在于大肠杆菌中,而非酵母和农杆菌细胞。通过改良酵母同源重组方法,成功构建了有/无内含子intron 2的PLDMV侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2,农杆菌注射接种番木瓜均发病,侵染效率达64.7%~69.7%。本研究通过酵母同源重组质粒直接转化农杆菌,建立了一种10 d内即可稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的E.coli-Free酵母同源重组新方法。该方法对其他在大肠杆菌中不稳定的植物病毒侵染性克隆的构建具有重要意义。

番木瓜PRSV和PLDMV复合侵染中呈中性互作

商业化的抗番木瓜环斑病毒(papayaringspotvirus,PRSV)的转基因番木瓜品种‘华农1号’的应用成功控制了华南地区该毁灭性病毒。然而近年来在广东和海南的一些转基因或非转基因植株上发现了另一种具有严重危害的病毒——番木瓜畸形花叶病毒(papayaleafdistortionmosaicvirus,PLDMV)。为了明确这两种病毒在番木瓜上的相互关系,通过人工接种分析二者在转基因和非转基因番木瓜上的侵染率、症状、细胞病理变化以及病毒积累量等特征。结果表明,‘华农1号’对PRSV有很强的抗性,但对PLDMV却高度感病,且PLDMV并不能协助PRSV克服转基因番木瓜对其的抗性;两种病毒单独侵染和复合侵染非转基因番木瓜均能引致严重的症状,二者症状无明显差异。细胞病理学分析表明,病毒侵染后叶片叶绿体萎缩且排列不紧凑,复合侵染并未对叶肉细胞造成更为严重的损害。接种PRSV的转基因番木瓜15d后PRSV积累量逐渐减少,直至检测不到;而接种PLDMV后其积累量逐渐升高并保持在一个较高的水平。在转基因和非转基因番木瓜上,PRSV的积累量始终低于PLDMV,在非转基因番木瓜上,两种病毒长期共存,并各自维持相应的病毒含量。这些结果表明,抗PRSV的转基因番木瓜‘华农1号’不抗PLDMV;PRSV和PLDMV复合侵染没有在番木瓜植株中发生协生关系,表现为中性互作。