重组大肠杆菌产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶分批补料发酵工艺

为了获得低成本的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL),在5L发酵罐发酵中对工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-TLL的分批补料发酵工艺进行研究。结果表明:以葡萄糖为碳源的补料培养基,采用溶氧(DO)反馈补料策略进行补料,当OD600=60时降温至28℃,分2次加入终质量浓度为30g/L乳糖进行诱导表达。优化后TLL的表达量提高到798.5U/L,是优化前的2.4倍。本研究为规模化发酵重组菌生产TLL奠定了基础。

VKT多肽介导的固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶催化制备生物柴油

生物柴油是一种环境友好的生物液体燃料,对于酶法生产生物柴油,迫切需要找到廉价和高效的固定化脂肪酶。本研究利用固体结合肽(SBPs)VKT,将其与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)融合构建融合脂肪酶,并将其固定化在硅基材料上,获得了一种新型的生物催化剂。在所测试的硅基材料(ZSM-5、Na-Y、SAR-100、MCM-41和SiO_(2)微粉)中,固定在ZSM-5沸石上的TLL-VKT(TLL-VKT@ZSM-5)表现出最佳的固定化效率和最大负载,且具有优异的pH、温度、储存和洗脱稳定性。以TLL-VKT@ZSM-5为生物催化剂,对麻疯树籽油进行转酯化反应,48h生物柴油得率即达到93.9%。此外,TLL-VKT@ZSM-5还表现出较高的重复使用性能,在7次重复使用后,生物柴油得率依然保持71.9%。本研究的酶固定化方法具有简单高效、稳定性高和重复使用性能高等优点。本研究显示VKT肽在酶蛋白固定化的应用方面具有较好前景。

疏绵状嗜热丝孢菌β-葡萄糖苷酶的基因组挖掘与表达

基因组挖掘是发现生物催化剂的高效工具,开发热稳定性β-葡萄糖苷酶具有重要的应用价值.该文采用基因组挖掘策略,从嗜热真菌疏绵状嗜热丝孢菌的基因组中挖掘出7个注释为β-葡萄糖苷酶基因或β-葡萄糖苷酶预测蛋白基因,其中TLG-1、TLG-2、TLG-4、TLG-5、TLG-6属于GH3家族,TLG-3和TLG-7分别属于GH1家族和GH17家族,且TLG-7与GenBank数据库已有序列的同源性很低,只有48.43%.选择同源性低的、同源序列被研究少的TLG-2、TLG-5、TLG-6和TLG-7进行基因克隆和毕赤酵母异源表达,重组毕赤酵母经甲醇诱导表达后,用发酵液上清进行SDS-PAGE分析,结果表明TLG-2、TLG-5、TLG-6和TLG-7均成功分泌表达.对发酵液进行β-葡萄糖苷酶活力测定结果表明:TLG-2的活力最高,达到166.6 U·mL^(-1);其次是TLG-5的活力,其值为79.8 U·mL^(-1),TLG-6和TLG-7的活力较低,分别为9.9 U·mL^(-1)和9.5 U·mL^(-1).研究结果为疏绵状嗜热丝孢菌β-葡萄糖苷酶的应用奠定了基础.

毕赤酵母重组菌高密度发酵产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶

疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL是一种热稳定、具有位置专一性等良好属性和应用前景的脂肪酶,已成功在多种宿主中实现重组表达。本研究构建含前导肽的TLL脂肪酶毕赤酵母重组工程菌,在摇瓶水平对该重组工程菌的培养和诱导条件进行优化,通过单因素试验,得到的最佳发酵条件:1.5%(体积分数)甲醇,pH 7.0,质量分数0.5%玉米油和0.1%阿拉伯胶,该条件下摇瓶发酵最高酶活为2 265.3 U/mL。以甲醇为唯一碳源进行高密度发酵,202 h后菌体OD600值达到最高282,对应发酵上清液的最高酶活为22 561.4 U/mL。参考摇瓶优化结果,采用辅助碳源与甲醇共诱导高密度发酵,培养和诱导208 h后,最终菌体OD600值达到362,对应发酵上清液的最高酶活为24 522.6 U/mL,较以甲醇为唯一碳源的对应值分别提高了28.37%和10.87%。另外,最高酶活较摇瓶水平发酵的最高酶活2 265.3 U/mL提高10.83倍,表明高密度发酵和共诱导是大幅提高酵母表达重组TLL蛋白的重要手段。

疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达和性质鉴定

通过密码子优化改造编码sn-1,3位置专一性疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)基因,同时通过重叠PCR技术合成该基因,并将其克隆到巴斯德毕赤酵母的表达载体p PIC9K中。结果表明,TLL脂肪酶被高效胞外表达,在摇瓶中发酵168 h得到的发酵液的上清脂肪酶表达量达到0.1 mg/m L,对应的p NPP水解酶活达到312.72U/m L。与对应的原始编码基因重组菌酶活(179.42 U/m L)相比,密码子优化后酶活提高74.29%,表明密码子优化策略成功提高了TLL在巴斯德毕赤酵母中的重组表达。比较毕赤酵母来源的重组TLL与商业化的米曲霉酶学性质发现它们具有相似的最适p H和温度耐受范围。另外,它们在有机溶剂耐受性、表面活性剂和金属离子效应以及位置选择性方面均较为相似,表明毕赤酵母来源的重组TLL同样具有商业化应用的潜力。

疏棉状嗜热丝孢菌耐热脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达

综合考虑密码子偏爱性、RNA稳定性以及自由能等因素,对疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)耐热脂肪酶(tll)基因序列进行密码子优化并全基因合成。将合成的tll基因连接到克隆载体,然后亚克隆到表达载体pHGWPT-tll,采用根癌农杆菌介导转化无孢黑曲霉SH-2。经过三丁酸甘油酯平板、SDS-PAGE以及Western Blotting鉴定,成功表达了tll基因。发酵72h,转化子脂肪酶酶活最高达36U/mL。转化子经等离子诱变得到的突变株的脂肪酶比活力比出发菌株提高约37%。

重组疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶对面包烘焙品质的影响

为探究重组疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Recombinant Thermomyces lanuginosus Lipase Produced by Pichia pastoris,PTL)在面包体系中的使用效果,试验以面包比容、组织结构以及面包芯白度为指标得出其最佳用量。进一步研究比较PTL、商业脂肪酶Lipopan F BG(以下简称FBG)、化学改良剂双乙酰酒石酸单(双)甘油酯(Diacetyl Tartaric Acid Ester of Mono(di)Glycerides,DATEM)对面包烘焙品质的影响,对面团面筋网络结构及面包芯风味物质分别采用扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法(Head-Space Solid Phase Micro-Extraction Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometer,HS-SPME-GC-MS)进行分析。结果表明,PTL在面包中的最佳用量为10~20 mg/kg,过量PTL造成不良影响。PTL在增大面包比容、强化面筋结构和提高感官整体接受度等方面仅次于FBG,优于DATEM。面包配方中加入15 mg/kg PTL能明显增大面包比容(9.8%),降低面包硬度,气味和组织结构的感官得分最佳(6.48分和6.82分)。综上,适量PTL能有效改善面包的烘焙品质且具有不同于商业酶的独特优势。

疏绵状嗜热丝孢菌原生质体的制备与再生

以疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)为供试菌株,研究了菌龄、酶的种类及浓度、酶解时间、酶解温度和稳渗剂对原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明,制备嗜热丝孢菌原生质体比较适宜的条件为:PDB液体培养基培养28 h,以0.7 mol/L NaCl为稳渗剂,0.15 mol/L的溶壁酶,30℃酶解4 h。原生质体再生以0.7 mol/L蔗糖作稳渗剂为最佳。

末端环化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的稳定性

目的:获取活性高、稳定性好的工业脂肪酶。方法:利用哺乳动物细胞和大肠杆菌分别表达Butelase 1和梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL),通过Flag亲和层析和His亲和层析柱进行纯化;通过纯化的Butelase 1连接酶对重组TLL(rTLL)进行末端连接,以形成首尾相连的环状TLL(cTLL),通过测定rTLL和cTLL活性、热稳定性、蛋白酶稳定性、抗热聚沉能力等,研究环化处理对脂肪酶的影响。结果:纯化后cTLL与rTLL的比活基本相当;70℃下处理180 min,cTLL大部分可保持可溶状态,相同条件下线性蛋白TLL几乎完全沉淀或降低;环化后的脂肪酶cTLL粒径均一、分子量分布均匀,具有更稳定的蛋白特性。结论:Butelase 1可有效地环化梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶,环化后的蛋白酶酶活未改变,热稳定性大大提高,蛋白特性更好。

疏棉状嗜热丝孢菌热稳定蛋白酶的分离和纯化

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶,广泛存在于各种生物体中.它们不仅对生物体内蛋白质的新陈代谢起调节作用,而且在酿造、发酵、食品、日用化工、纺织、制革、医药等工业和农业领域中具广泛应用价值.热稳定蛋白酶是目前研究和开发的新酶种,由于它在高温条件下的热稳定性和高活力,因此不仅具有重要应用前景,而且对理论上阐明酶的耐热机制具有重要意义.近几年,从嗜热微生物中分离热稳定蛋白酶引起人们的注意.国内外学者已从嗜热真菌中分离和纯化热稳定蛋白酶.关于从嗜热真菌中分离和纯化热稳定蛋白酶的研究报道很少.国外Ong ＆ Gaucher(1975)对嗜热真菌Malbranchea pulchella var.sulfurea的蛋白酶进行了分离纯化研究.国内Li D.C.et al(1997)(李多川等)研究了嗜热真菌疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的热稳定蛋白酶的产生条件及特性.本文报道这种嗜热真菌稳定蛋白酶的分离和纯化.将分离到的疏棉状嗜热丝孢菌高产菌株在含酪蛋白的液体培养基中50℃条件下静止培养12d,培养滤液经硫酸铵分级沉淀(50％～90％饱和度)和Butyl-Sepharose疏水层析,得到了凝胶电泳均一的2种蛋白酶同功酶(同功酶I和同功酶Ⅱ).2种同功酶在Butyl-Sepharose上的层析行为有很大差异.

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的表面展示及酶学性质

【目的】构建疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)在毕赤酵母GS115中的细胞表面展示体系,筛选展示成功且酶活力及展示率较高的重组子作为全细胞催化剂,并研究其酶学性质。【方法】克隆TLL基因tll,以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白,构建表面展示载体pPICZαA-TLS。重组载体经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母GS115中,经三丁酸甘油酯平板检测及摇甁发酵筛选获得高酶活力的毕赤酵母重组子,采用抗FLAG标签一抗和R-PE荧光素标记的二抗处理细胞后,进行荧光显微镜检测和流式细胞仪分析,并考察全细胞催化剂的最适反应温度和pH、金属离子耐受性等酶学性质。【结果】成功构建TLL毕赤酵母细胞表面展示体系,筛选到1株具有三丁酸甘油酯和橄榄油水解活力的克隆子,经1%的甲醇诱导发酵120 h后,水解橄榄油酶活力达257.8 U/g干细胞。经抗体处理后的重组菌发酵细胞在荧光显微镜下呈现强烈的红色荧光,流式细胞仪分析结果也证实脂肪酶被成功展示在酵母细胞表面,展示率达98.36%。展示的TLL作为全细胞催化剂水解对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)的最适温度为30℃,最适pH为8.0,且具备良好的热稳定性和有机溶剂耐受性;K+、Ca2+、Mg2+对其有微弱的激活作用,Mn2+、Ni2+则有微弱的抑制作用,Cu2+的抑制作用较强,而EDTA、SDS、Tween 20对酶活力影响不明显。【结论】首次将TLL脂肪酶成功展示在毕赤酵母细胞表面,获得具有较高水解活力和良好酶学特性的全细胞催化剂,为表面展示TLL脂肪酶的规模化应用奠定了技术基础。

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus TP-1的培养及其产木聚糖酶性质研究

从高温酒曲中分离获得1株丝状真菌,暂定为梳棉状嗜热丝孢菌。该菌适宜高温条件生长,木聚糖酶活力也是高温下较高,酶的最适温度为55℃,最适pH为5～7,金属离子对酶活有一定的影响,用GPC方法测定木聚糖酶的分子质量为6500u。

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在大肠杆菌中的表达与纯化

目的:实现疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus Lipase,TLL)在大肠杆菌中的可溶性表达,并建立有效的纯化方法。方法:根据疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,合成了疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶DNA序列,克隆至大肠杆菌表达载体PET-32a(+)中,通过筛选得到阳性重组载体,并转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导表达并利用SDS-PAGE电泳检测重组脂肪酶表达情况,并通过Ni柱亲和层析对目的蛋白TLL进行纯化,透析脱盐后,TEV酶切重组融合蛋白,再利用亲和层析纯化得到酶切后的脂肪酶,检测其酶活。结果:得到了可溶性表达的TLL,检测酶切前后脂肪酶的比活性:酶切前达5.7×106U/mg,酶切后达8.9×105U/mg。结论:实现了疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的可溶性表达,并得到有效纯化,同时证明TEV酶切目的蛋白对其活性影响微小,为之后对其进行环化打下基础。

疏绵状嗜热丝孢菌的糖基化热稳定锰超氧化物歧化酶及真菌锰超氧化物歧化酶的系统学（英文）

疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus是一种广泛分布的嗜热真菌,产生的酶在高温条件下具有高活性和稳定性。从该嗜热真菌中克隆了一种锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)基因Tlmnsod1(EU364837),cDNA全长791bp,开放阅读框654bp,编码217个氨基酸,没有信号肽和前导肽序列。Tlmnsod1基因在酵母中高效表达,经纯化获得了电泳均一分子量约为27kDa的重组蛋白TlMnSOD1。表达的TlMnSOD1酶是糖基化蛋白,具高的热稳定性,最适反应pH和温度分别为8.0和55℃。通过对真菌的40种锰超氧化物歧化酶的细胞定位和系统学分析可知:真菌的锰超氧化物歧化酶可以分为胞内MnSOD、线粒体MnSOD和胞外MnSOD;锰超氧化物歧化酶可以作为分子标记来研究真菌的进化关系;3种嗜热真菌MnSOD分别与非嗜热真菌MnSOD聚类在3个不同的组中。本研究为MnSOD的糖基化和作为分子标记用于真菌种的鉴定提供了证据。

疏绵状嗜热丝孢菌外切β-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特征

【目的】疏绵状嗜热丝孢菌是一种嗜热丝状真菌,具有合成与分泌多种耐热酶的能力,从中找寻酶活高、耐热性能优良的β-葡聚糖酶。【方法】对疏绵状嗜热丝孢菌其中一个外切β-葡聚糖酶的编码基因gln B进行克隆,并在毕赤酵母GS115中表达。【结果】在摇瓶水平上重组菌的产酶活为11.5 U/m L,重组酶在SDS-PAGE中的大小约为48 k D。重组Gln B最适作用温度为65°C,最适作用p H为5.0;在低于50°C或p H 3.0-10.0之间具有良好稳定性。重组酶水解海带三糖,首先生成单糖和二糖,延长酶作用时间,可以进一步将其中的二糖部分水解为单糖。【结论】疏绵状嗜热丝孢菌来源的重组酶Gln B为外切β-葡聚糖酶,具有较好的耐热性能和p H稳定性。

农杆菌介导的获取疏绵状嗜热丝孢菌插入突变体体系的建立(英文)

【目的】建立疏绵状嗜热丝孢菌的稳定遗传转化体系并获得插入突变体。【方法】利用农杆菌介导的方法建立疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化体系;分别通过Southern杂交、克隆转移DNA(T-DNA)侧翼序列来确定T-DNA在疏绵状嗜热丝孢菌基因组中的拷贝数和插入位点。【结果】成功建立了可靠的疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化体系。共培养过程中使用萌发孢子是成功建立疏绵状嗜热丝孢菌遗传转化体系的必要条件。疏绵状嗜热丝孢菌萌发的孢子与农杆菌在28℃共培养48h时,转化效率最高。乙酰丁香酮(AS)在农杆菌预培养及疏绵状嗜热丝孢菌萌发的孢子与农杆菌的共培养阶段都是必需的,且在共培养阶段当AS浓度为500μM时转化效率最高。Southern杂交验证表明,79.2%的转化子为T-DNA单拷贝插入,且通过热不对称PCR(TAIL-PCR)分析得出T-DNA在该菌基因组中的插入位点是随机的。通过该转化系统筛选到部分表型突变体。【结论】我们首次报道了利用ATMT技术成功转化嗜热真菌-疏绵状嗜热丝孢菌,证明了该方法是一种简单有效的获得插入突变体的方法,并为该嗜热真菌进行基因定位提供了工具。

一种耐热几丁质酶的产生及其稳定性研究

疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）SY2在以胶状几丁质为唯一碳源的诱导培养基中产生了胞外几丁质酶。该酶在50℃保温1h，酶活稳定：65℃时半衰期为25min；酶液在室温下保存到12周，残余酶活性为45％左右。该酶有较宽的pH范围，3．0-9．0之间保持稳定，pH值为2．5时，仍具有70％的剩余酶活性。Ca^2＋对几丁质酶的活性有显著的激活作用；高浓度变性剂对酶有抑制作用。结果表明该酶是一种热稳定性高且耐酸碱的新型几丁质酶，能在酸性和高温环境中发挥作用，这些特性赋予了T.lanuginosus几丁质酶在几丁质的生物转化及其它生物技术中极大的应用优势。

整合宏组学方法研究番茄与玉米秸秆共堆肥生境中的关键微生物及其功能

【目的】探究番茄秸秆与玉米秸秆共堆肥发酵过程中的关键微生物及其功能,以进一步加速其发酵进程。【方法】以番茄秸秆和玉米秸秆为原料,二者按质量比3∶1混合进行条垛式堆肥,每周采集发酵堆20~50 cm深度样品检测木质纤维素酶活力的变化,以酶活力最高时期的代表性样品为研究对象,对其进行高通量焦磷酸测序和Orbitrap宏蛋白质组学研究。【结果】多数真菌隶属于子囊菌门Ascomycota,其中嗜热丝孢菌Thermomyces的相对丰度最高,约占真菌全部序列的70.5%,该属真菌主要分泌内切-1,4-β-木聚糖酶,是主要的半纤维素降解真菌。主要细菌为放线菌门Actinobacteria、变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes,三者共占细菌总序列数的87.0%。其中,嗜热裂孢菌属Thermobifida和糖单孢菌属Saccharomonospora是主要的放线菌属,其相对丰度分别占全部细菌序列的16.5%和1.36%。Thermobifida是唯一的纤维素降解菌,鉴定到4种内切纤维素酶组分和3种外切纤维素酶组分;同时产生一种果胶裂解酶和一种β-木聚糖酶。Saccharomonospora分别产生一种β-木聚糖酶、两种丝氨酸蛋白酶和两种胰蛋白酶,在半纤维素的降解和蛋白质降解方面发挥重要作用。Idiomarina是变形菌门下的主要细菌属,平均相对丰度15.6%,主要参与蛋白质的降解。而厚壁菌门下的清野氏菌属Planifilum虽基因丰度不高(仅为1.23%),但却在半纤维素的降解过程中发挥重要作用。【结论】将高通量焦磷酸测序和Orbitrap宏蛋白质组学结合的整合宏组学方法在探明复杂生境中关键微生物的群落结构及功能方面具有可行性。

具协同催化效应的毕赤酵母全细胞催化生物柴油制备

以表面共展示具协同催化效应的南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)与嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)重组毕赤酵母全细胞作为催化剂催化生物柴油制备,考察了生物柴油制备条件,并进行了初步优化。结果表明,共展示CALB与TLL脂肪酶毕赤酵母全细胞在叔丁醇介质体系中可有效催化生物柴油制备。冻干酵母细胞量0.31 g/g油,醇油摩尔比4∶1,温度35℃,反应36 h,生物柴油得率达86.25%。

虎杖苷十一碳烯酸酯的酶法合成与动力学研究

为建立绿色、高效、高选择性合成虎杖苷十一碳烯酸酯双前药的生物催化体系,本研究以棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶(TLL)为催化剂,以反应介质、底物摩尔比、温度及反应时间等因素为变量,探究了TLL催化虎杖苷十一碳烯酰化反应的特性。结果表明,TLL可在丙酮中实现对虎杖苷的高效转化,产物均为6″-单酯(100%);在最优条件下,该酶促反应的初速度、底物转化率和6″-区域选择性分别达20.8 mmol·L^(-1)·h^(-1)、100%和100%。TLL在不同有机介质中催化虎杖苷酰化反应的动力学特征差别较大,但在丙酮中的K_(m)值最小、V_(max)和V_(max)/K_(m)最大,分别为24.7 mmol·L^(-1)、68.9 mmol·L^(-1)·h^(-1)和2.79 h^(-1),表明在丙酮中酶与底物的亲和力更强,催化效率更高,因此丙酮是该酶促反应的适宜溶剂。本研究不仅丰富了非水相酶学基础理论知识,更为绿色高效的酶催化技术改造传统化学合成过程提供了借鉴。