疣孢漆斑菌发酵液的化学成分及其农药活性的研究

对一株羌活内生真菌—疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)的发酵液进行化学成分研究,采用乙酸乙酯萃取,硅胶柱色谱和制备型HPLC等色谱手段分离、纯化,从中分离得到14个单体化合物。通过理化性质与波谱数据分析,分别鉴定为:疣孢菌素B(1)、8-乙酰基漆斑菌素H(2)、疣孢菌素M(3)、疣孢菌素J(4)、漆斑菌素D(5)、乙酰基疣孢菌素L(6)、异漆斑菌素E(7)、漆斑菌素E(8)、漆斑菌素H(9)、漆斑菌素A(10)、乙酰基漆斑菌素E(11)、Isotrichoverrin A(12)、Isotrichoverrin B(13)、疣孢菌素A(14)。其中化合物2、6、7为首次从该种真菌中分离得到。并对14个化合物进行农药活性测试,结果表明化合物10 ppm对拟南芥有显著的生长抑制作用,32 ppm对早熟禾有生长抑制作用,1000 ppm对绿棉铃虫的致死率大于70%,具有良好的除草和杀虫活性。这为进一步开发疣孢漆斑菌作为生物除草剂和杀虫剂提供理论依据。

疣孢漆斑菌发酵液正丁醇部位化学成分研究

目的:对疣孢漆斑菌发酵液正丁醇部位进行化学成分研究。方法:采用各种提取分离纯化技术进行化学成分分离,运用波谱技术进行结构鉴定。结果:从疣孢漆斑菌发酵液正丁醇部位分离鉴定了14个化合物,分别鉴定为:分别为cyclo-(Pro-Phe)(1)、cyclo-(4-OH-Pro-Phe)(2)、cyclo-(4-OH-Pro-Leu)(3)、cyclo-(Ala-Pro)(4)、cyclo-(4-methyl-Pro-9-propyl-Gly)(5)、cyclo-(Pro-Gly)(6)、cyclo-(Phe-Gly)(7)、cyclo-(Leu-Leu)(8)、N-乙酰色胺(9)、N-(2-苯乙基)乙酰胺(10)、N-(2-羟基苯乙基)乙酰胺(11)、N-(4-羟基苯乙基)乙酰胺(12)、尿嘧啶(13)、胸腺嘧啶(14)。结论:所有化合物均为首次从该真菌中分离得到。

主要营养和环境因素对疣孢漆斑菌X-16菌株产孢的影响

营养条件和环境因素影响疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)的产孢量,对其进行研究能为疣孢漆斑菌的发酵提供理论支持。采用产孢量测定了不同碳氮比、碳氮源、碳浓度、温度、pH及光照对寄生根结线虫的疣孢漆斑菌X-16菌株产孢量的影响。结果表明,X-16菌株对碳源、氮源等营养的利用存在显著差异;X-16菌株产孢量以可溶性淀粉和硝酸钠最高,产孢量分别为7.87×108,1.027×109个/m L;C/N是60∶1时,产孢量最高;碳浓度为1～2 mol/L时最有利于平板产孢;X-16菌株在30～32℃时产孢量最高;适宜产孢的pH值为6.5;24 h光照有利于产孢。建议生产中可根据实际发酵情况选择最佳营养和环境条件。

广西地不容内生真菌疣孢漆斑菌DBR-11的抑菌活性

为了研究广西地不容内生真菌的抑菌活性,从广西地不容块根中分离纯化出18株内生真菌,采用拮抗试验测定了其对10种植物病原真菌的抑制活性,发现疣孢漆斑菌DBR-11对多数供试菌有很好的抑制活性。进一步测定了DBR-11菌株发酵产物的抑菌活性,发现发酵产物的乙酸乙酯萃取物对病原菌的抑制活性较高,质量浓度为5 g/L时,对10种植物病原真菌的抑菌率均在90%以上,有效中浓度（EC50）为0.007 2~0.446 5 g/L,其中对烟草黑胫病菌的毒力最高,EC50值为0.007 2 g/L;发酵产物的乙酸乙酯萃取物质量浓度为2 g/L时,72 h对15种供试动物病原菌中的7种能完全抑制,最低抑制浓度（MIC）为0.062 5~0.25 g/L,其中对痢疾志贺氏菌的抑制活性最高,MIC值为0.062 5 g/L。DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物有广谱的抗菌活性,具有潜在的应用价值。

产漆酶疣孢漆斑菌Ws2-6原生质体制备条件的研究

通过对酶的种类、酶的组合、酶液浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂等因素的研究获得了制备疣孢漆斑菌原生质体的有效条件。采用浓度为0.7mol/L氯化钠为渗透压稳定剂,在pH6的磷酸缓冲体系中,以15mg/mL溶壁酶、5mg/mL纤维素酶R-10和10mg/mL蜗牛酶的混合酶液处理培养18h的菌丝体,30℃、80r/min振荡酶解6h,原生质体产生量达到最大值为7.83×106个/mL。此外,对原生质体释放的跟踪观察发现,疣孢漆斑菌原生质体释放有顶端、侧端释放2种方式。

疣孢漆斑菌(Myrothecium Verrucaria)J-1胆红素氧化酶的纯化及性质初步研究

从中国土样中筛选到一株能产生胆红素氧化酶的微生物(Myrothecium Verrucaria)J-1,培养后,分离纯化,最后经QAE—Sephadex A50柱层析,得到胆红素氧化酶比活为207.65 U/A 280nm,总产率为22.3％。纯酶紫外吸收峰为278 nm,凝胶电泳为单一色带。分子量估计为52000。它能迅速、特异地氧化胆红素为胆绿素,并进一步氧化成目前还不清楚的紫色化合物。最佳作用pH为7.0,最佳作用温度为40℃。

疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria GH-01漆酶的纯化和酶学性质研究

疣孢漆斑菌具有生长周期短,分泌漆酶酶活高等特点。利用已分离得到的疣孢漆斑菌GH-01(Myrothecium verrucaria GH-01)发酵产生粗酶液。进而通过分级沉淀、透析和层析的方法对漆酶粗酶液进行纯化。SDS-PAGE和Native-PAGE结果表明纯化可获得具有漆酶活性的单体蛋白。酶学性质研究表明,该漆酶催化最适温度为40℃,在底物ABTS存在条件下的最适p H值为4.0,且在低温及碱性条件具有较好的稳定性。此外通过漆酶对4大类染料脱色能力的研究,发现该漆酶对偶氮类的橙黄Ⅰ和蒽醌类的茜素红脱色有较好的脱色效果,反应1 h脱色率达80%以上;对三苯甲烷类的碱性品红脱色能力较弱,脱色率只能达到20%左右;脱色率最差的是杂环类的亚甲基蓝。在含10 U漆酶的体系中,对50 mg/L的染料降解效果相对最佳。

疣孢漆斑菌产胆红素氧化酶条件优化及对染料脱色的研究

疣孢漆斑菌代谢产生的胆红素氧化酶在环境保护等领域有较大的应用潜力。为了提高胆红素氧化酶的产量,采用单因素试验和正交试验相结合的方法,研究培养基中C、N、金属离子及诱导剂对疣孢漆斑菌3.2190产酶的影响。结果表明,在产酶培养基中,葡萄糖和大豆蛋白胨为最适C源和N源,添加2mmol/L铜离子和0.1mmol/L的诱导剂均可以提高发酵液的酶活。正交试验得到的优化组合为:葡萄糖10g/L,大豆蛋白胨7.5g/L,CuSO41mmol/L,没食子酸0.1mmol/L,优化后发酵液酶活提高了3倍。初步纯化的胆红素氧化酶最适反应温度为40℃,最适pH值为7.5。在1000U/L的酶活下,只需50min就可以降解90%以上100mg/L的染料靛红,显示出胆红素氧化酶在染料废水处理中具有广阔的应用前景。

真菌电化学修复除草剂污染土壤:降解动力学探索

【目的】微生物燃料电池(microbial fuel cell,MFC)在去除污染物的同时产出电能,是一种颇有前景的生态修复手段。构建真菌强化MFC装置,比较电动力(EK)、真菌、MFC修复除草剂污染土壤效果及优缺点,探索MFC在有机污染物修复中的应用潜力。【方法】设计了一种添加真菌进行生物强化的MFC,并用EK、真菌、MFC三种方法修复两种除草剂污染的灭菌土壤。经筛选和驯化的疣孢漆斑菌和踝节菌菌株用于后两种方法,研究真菌强化对MFC去除除草剂的影响。测量土壤pH、电导率、除草剂去除率,MFC产电性能,用气相色谱-质谱鉴定两种除草剂的降解产物。【结果】EK修复中,添加模拟电解液、碳纤维条、加电10 V的处理组7 d后氯氟吡啶酯(F)和高效氟吡甲禾灵(H)去除率分别为71%和38%。真菌、MFC处理F的最大去除率达到100%。对比踝节菌,疣孢漆斑菌对两种除草剂的降解性能更好,疣孢漆斑菌、踝节菌单菌构建的MFC对H的去除率分别为62.5%和24.1%。F降解产物为氟氯吡啶酸,H降解产物为乙酸大茴香酯,推测了降解路径和降解动力学。三种方法降解F以及EK降解H均符合动力学一级反应,而真菌和MFC降解H符合二级反应。【结论】对比EK、真菌修复,MFC修复效果更好,该方法可以较快地修复土壤又无需额外供电,是一种经济有效的自持式修复策略。

产杀虫抗菌单端孢霉烯族毒素海绵真菌Myrothecium verrucaria Hmp-F73的筛选和鉴定

从98株分离自大连海域繁茂膜海绵Hymeniacidon perleve共附生的真菌中,筛选得到具有较强杀虫抗菌活性的丝状真菌Hmp-F73。96孔板卤虫生物检测(brine shrimp assay,BSA)结果显示,该菌株发酵滤液甲醇提取物浓度为0.25μg.mL-1时,卤虫校正死亡率为100%;甲醇提取物经硅胶柱层析洗脱得到7个馏分,其中馏分3浓度为400μg.mL-1时对甜菜夜蛾具明显抑制取食活性,拒食率达到85.25%;1mg.mL-1的馏分6对玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani抑菌圈直径达9.25mm。经色谱柱层析分离纯化得到4个杀虫抗菌活性化合物,氢核磁数据显示这些化合物均属于12,13-环氧单端孢霉烯族化合物。通过形态、培养特征及ITS1-5.8S-ITS2序列分析,将该菌株鉴定为疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria。

大豆孢囊线虫生防菌株Myrothecium verrucaria ZW-2发酵条件优化及活性物质分析

疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)ZW-2菌株对大豆孢囊线虫具有(Heterodera glycines)明显的杀线虫活性,为了确定该菌株的最优发酵条件以及代谢产物,采用4因素3水平的正交试验进行了发酵条件优化以及代谢组学分析。结果表明:菌株ZW-2以Czapek培养基为基础培养基,最佳培养温度为28℃,摇床转速为180 r/min,装瓶量为100 mL,培养基pH为8,最佳碳源和氮源为蔗糖和硝酸钠。经代谢组学分析,根据代谢物质荷比、精确分子量及一级碎片离子得分等信息共筛选出20种差异代谢物,包括酰胺类化合物和脂肪族化合物。菌株ZW-2上述试验结果为进一步开发利用该菌株提供重要的理论和应用价值。

一种真菌对人参皂苷Rg_3的转化

【目的】筛选长白山人参土壤中的活性微生物,转化人参总皂苷及单体人参皂苷产生稀有抗肿瘤成份。【方法】从长白山人参根际土壤中分离各类菌株,对人参总皂苷及单体人参皂苷进行微生物转化,并通过硅胶柱层析等方法对转化产物进行分离纯化,采用波谱解析及理化常数对其进行结构鉴定;结合菌落形态、产孢结构、孢子形态特征以及菌株ITS rDNA核酸序列分析,对活性菌株进行鉴定。【结果】从长白山人参根际土壤中分离各类真菌菌株68株,有12株菌株对人参总皂苷有转化活性,其中菌株SYP2353对二醇组人参皂苷Rg3具有较强的转化活性。【结论】阳性菌株SYP2353被鉴定为疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria),能将人参皂苷Rg3转化为稀有人参皂苷Rh2及二醇组人参皂苷苷元PPD,为稀有人参皂苷Rh2的制备提供了新的方法。

产漆酶疣孢漆斑菌NF-05的分离及对偶氮染料的脱色

以木质素磺酸钠为唯一碳源的培养基对带岭凉水自然保护区土壤样品进行富集培养,涂布于愈创木酚-PDA平板。经2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)和丁香醛联氮(SGZ)平板检测初筛,ABTS法测定摇瓶发酵液酶活力复筛,筛选到一株漆酶高产真菌NF-05。形态学观察结合rDNA-ITS序列分析,鉴定该菌为半知菌疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria。该菌株在液体产酶培养基中生物量积累与产酶基本同步,发酵第5天达到产酶高峰,最高酶活力为8,375.87U/L。纯化漆酶对偶氮染料脱色研究结果表明,该酶在96h对甲基橙脱色率达到90%以上,以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TE)为介体时,48h脱色率即达90%以上;该酶在24h对橙黄Ⅰ的脱色率即达90%以上;以TE为介体时,该酶在24h即使橙黄G6完全脱色。

越南槐内生真菌GRPH-0的抗真菌活性及其鉴定

目的为新型抗生素的研究提供有价值的菌种资源。方法采用改良的琼脂扩散法从越南槐内生真菌中筛选拮抗白念珠菌的活性菌株并测定其对念珠菌属真菌的抑菌谱;以改良的微量肉汤稀释法测定其代谢产物的抗菌活性;根据形态和分子特征鉴定该菌株的分类学地位。结果菌株GRPH-0活菌块对白念珠菌的抑菌圈直径比阳性对照大,并且对参试念珠菌属真菌均具有不同程度的抑制作用,具有较广的抑菌谱;其代谢产物对白念珠菌及其多重耐药临床分离株的最小抑菌浓度均为4μg/m L,仅为阳性对照的16倍;初步鉴定该菌株为疣孢漆斑菌。结论菌株GRPH-0鉴定为疣孢漆斑菌,对参试病原真菌均显示强的抗真菌活性,具有较大的开发应用潜力。

产漆酶半知真菌Myrothecium verrucaria NF-08菌株的分离及产酶研究

【目的】采集凉水国家级自然保护区原始森林土壤样品,分离产漆酶真菌并优化产酶条件,旨在开发产漆酶半知真菌种质资源,提高漆酶产量,为微生物漆酶扩大生产提供菌种资源和条件参数。【方法】以木质素磺酸钠为唯一碳源的无机盐培养基为富集培养基,在愈创木酚-PDA选择性平板上分离产漆酶真菌。利用ABTS[2,2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]和SGZ[4-羟基-3,5-二甲氧基-苯甲醛连氮,即丁香醛联氮]显色反应初筛和摇瓶发酵复筛。确定供试菌株后,利用形态观察结合r DNA-ITS序列分析技术,将菌株鉴定至种。以ABTS法测定供试菌发酵液漆酶活性,以Lowry法测定发酵液总蛋白含量。在考察供试菌株生长、产酶及胞外蛋白总量动态变化基础上,通过单因素试验,研究碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、培养基起始p H、装液量、接种量及底物诱导对菌株产漆酶的影响,获得菌株产酶最适培养基组分和培养条件参数。【结果】获得1株发酵周期短、初始酶活高的产酶菌株NF-08。结合形态学特征与r DNA-ITS序列分析结果,鉴定菌株NF-08属于为半知菌亚门疣孢漆斑菌。该菌株在液体发酵培养基中产漆酶活性与菌丝生长和胞外蛋白总量基本同步,发酵第6天达到酶活峰值9.28 U·m L-1。疣孢漆斑菌NF-08产酶最佳碳、氮源分别为4.0%葡萄糖和3.5%蛋白胨,培养基初始p H7.0。最适装液量60 m L·(250 m L)-1,最适接种量4%,最适培养温度和摇床转速分别为30℃和140 r·min-1。没食子酸、阿魏酸和单宁酸显著诱导疣孢漆斑菌NF-08漆酶活性的产生,以没食子酸效果最好。经过培养基组分和培养条件优化以及底物诱导,疣孢漆斑菌NF-08产酶水平达到16.82 U·m L-1,比优化前提高了81.25%。【结论】建立环境样品中产漆酶真菌的分离、纯化及筛选方法,获得了一株发酵周期短、产漆酶活力高的半知真菌疣孢漆斑菌NF-08。该菌株经单因素试验产酶条件优化效果明显,酶活水平提高显著,可为微生物发酵产漆酶提供新的菌株资源,在微生物发酵漆酶工业生产中具有应用潜力。后续对疣孢漆斑菌NF-08漆酶产生、性质及基因表达调控的深入研究,将有助于了解漆酶在半知真菌生活史中的作用及生态学功能,同时拓展半知真菌漆酶的应用领域。

胆红素氧化酶产生菌的选育及发酵工艺条件的研究

对胆红素氧化酶产生菌的菌和选育进行了研究。以科研室保藏菌种Mv9201为出发菌株，通过紫外线、硫酸二乙酯单独处理和复合诱变，从353株突变株中筛选出一株高产菌株MyrotheciumverrucariaMv9352，并对其产酶条件进行了研究。以20％的土豆汁（含0．25％的葡萄糖和蛋白胨）为发酵培养基，初始pH6～7，摇床转速为140～160r／min，24～26℃培养96h，酶活力可达4．0～4．5u／ml，比出发株的产酶能力提高近4．5倍。

壳聚糖铁固定疣孢漆斑菌球处理染料的研究

选择新疆本土产的疣孢漆斑菌作为固定化菌种,并与壳聚糖铁凝胶通过固定化手段有效结合起来,综合分析了壳聚糖铁固定化真菌脱色处理染料的过程机制,以及不同条件下的脱色率.结果表明：固定化真菌对染料的去除首先是染料积累的过程,其次是菌种降解的过程,壳聚糖铁的加入有效缩短了染料积累的时间,24 h的染料脱色率提升了1.5倍;壳聚糖铁固定化真菌对初始浓度为50~250 mg·L-1的酸性染料都有很好的去除效果.振荡培养使疣孢漆斑菌菌球的脱色效率最高提升14.4%.壳聚糖铁固定化菌球投加到染料后有较高的漆酶产量,48 h达到（81.40±3.18）U·mL-1.

发酵罐法培养疣孢漆斑菌产漆酶培养条件的研究

提高疣孢漆斑菌的漆酶产量,并且降低成本,使其得到大规模的应用,还要依赖于成熟的工业化发酵技术,因此实验选用16L全自动不锈钢发酵罐对疣孢漆斑菌菌种进行发酵培养,主要通过对不同通气量、搅拌速率和补加营养物质来研究疣孢漆斑菌发酵罐培养产漆酶的培养条件,以提高菌种漆酶产量。结果表明,通气量为1.0vvm时适于疣孢漆斑菌产漆酶,并且不会对设备产生过高的损耗;搅拌器转速为150r/min时,可以有效提高发酵液溶氧量,控制菌种生长,提高产酶活力;补加营养物质的研究显示,虽然没有达到预期的使产酶量出现二次高峰的效果,但补加营养物质可以延长菌种生长时间。

从进境美国苜蓿草中检出4种漆斑菌

本文作者从广东口岸进境的美国苜蓿(Medicago sativa)干草中检出露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、查氏漆斑菌(Myrothecium lachastrae)、禾谷漆斑菌(Myrothecium gramineum)。在我国,至今尚未有上述4种漆斑菌在苜蓿草的发生危害的记录。本文对上述4种漆斑菌的培养性状和形态特征进行描述,以期为口岸对进境苜蓿草漆斑菌的检疫鉴定提供参考。