疣粒野生稻WRKY基因家族全基因组鉴定和分析

WRKY转录因子是高等植物中成员数量较多的转录因子之一,在植物的生长发育和衰老、非生物和生物胁迫等过程中发挥着重要的作用。疣粒野生稻是栽培稻的近缘野生种,具有耐荫、耐旱和高抗白叶枯病等特性,是改良栽培稻的重要种质资源。本研究利用HMMER、Pfam、SMART、TBtools、NCBI软件和网站,在疣粒野生稻基因组中鉴定了94个编码WRKY转录因子的基因(OgWRKYs),不均一分布在12条染色体上,根据其所含WRKY结构域的数量和锌指结构的特征,分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组,II组成员最多(52个),与其他物种相似。除含有保守的WRKYGQK七肽序列外,还鉴定到6种变异类型,其中WRKYGHK、WRRYGQK、WRKYAKK和WRKYSQK是植物中首次报道的新变异类型。根据保守结构域分析,OgWRKY61、OgWRKY71和OgWRKY77a可能与植物抗病相关。KEGG pathway富集分析发现,有14个OgWRKY转录因子富集在植物-病原互作通路,其中10个同时富集在MAPK信号通路中。进一步结合顺式作用元件分析结果,推测OgWRKY30b、OgWRKY53、OgWRKY88、OgWRKY96和OgWRKY111可能在疣粒野生稻响应生物和非生物胁迫中发挥重要作用。qRT-PCR分析结果表明,OgWRKY30b、OgWRKY53、OgWRKY88和OgWRKY111基因的表达均受白叶枯病菌PXO99诱导,而OgWRKY96表达受白叶枯病菌侵染抑制。研究结果对疣粒野生稻中优异OgWRKYs基因资源的挖掘具有重要参考价值。

疣粒野生稻抗白叶枯病新基因的初步鉴定

以10个菲律宾白叶枯病菌小种和1个中国白叶枯病菌小种为供试菌系,以高感白叶枯病水稻品种IR24及携有不同抗白叶枯病基因的近等基因系IRBB1等16个材料作为参照,对粳稻品种8411/疣粒野生稻体细胞杂交获得的两个抗白叶枯病新种质SH5和SH76进行了白叶枯病抗谱鉴定。结果表明SH5和SH76在苗期的抗谱较广,并且与已知抗病基因的抗谱不同,但与IRBB5(xa5)和IRBB7(Xa7)相似。分别用xa5和Xa7的分子标记2F_1R和M5进行检测,确定SH5和SH76中不含有xa5和Xa7基因。初步推测SH5、SH76可能含有一个新的抗病基因或者一个连锁的基因簇群。

利用水稻C_0t-1DNA和基因组DNA对栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻基因组的比较分析

目的研究中高度重复序列在稻属不同物种基因组进化中的作用。方法用栽培稻C0t-1DNA和基因组DNA(gDNA)作为探针,分别对栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻进行荧光原位杂交(FISH)和比较基因组杂交(CGH)。结果C0t-1DNA覆盖栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻基因组比例(%)和大小(Mb)分别为47.10±0.16,38.61±0.13,44.38±0.13和212.33±1.21,269.42±0.89以及532.56±1.68。栽培稻gDNA在药用野生稻和疣粒野生稻基因组中的覆盖率约为91.0%和93.6%,含量分别约为634Mb和1123Mb,各有365Mb和591Mb不属于源自栽培稻基因组的中高度重复序列,未被栽培稻gDNA所覆盖的部分,分别为64Mb和78Mb左右。此外,以C0t-1DNA的组成为依据,对这3个种核型进行了同源性聚类。结论稻属中度和高度重复序列和功能基因一样,在不同种中也存在着高度同源性和保守性,并在进化过程中得以保存下来。药用野生稻和疣粒野生稻基因组增大的重要原因之一,可能是基因组中度和高度重复序列加倍的结果,药用野生稻这种序列扩增相对疣粒野生稻要缓和得多。另外,这两个野生种在长期进化过程中,由于存在加倍、重排和基因选择性丢失等现象,形成了具有自己种的特异性的基因组成分。

采用RAPD和ISSR标记探讨中国疣粒野生稻的遗传多样性

用随机扩增多态DNA (RAPD)和inter_简单重复序列 (ISSR)标记对分别来自中国海南和云南 2 0个居群的疣粒野生稻 (Oryzagranulata (NeesetArn .exWatt.) )混合样品 ,以及海南 (M5 )和云南 (M2 7) 2个居群各 2 0个植株的遗传多样性进行了检测。在混合取样的居群中 ,2 0个RAPD引物和 12个ISSR引物分别扩增出 2 0 9和 12 2条带 ,多态条带比率 (PPB)分别为 6 4.11%和 72 .95 %。对于分单株取样的居群 ,在M5中 ,两种标记分别扩增出 146和 95条带 ,PPB值分别为 2 1.48%和 34 .78%。在居群M2 7中 ,则分别扩增出 15 1(PPB =17.2 2 % )和 94(PPB =19.15 % )条带。结果表明 ,中国的疣粒野生稻在物种水平的遗传多样性较低 ,其遗传变异主要存在于海南和云南两地之间 ,而在居群内的遗传多样性水平很低。基于Jaccard遗传相似性系数的UPGMA聚类和基于多态条带表型的主成分分析 (PCA)都将中国的疣粒野生稻分为来自海南和云南两类 ,两地间该物种的平均遗传相似性分别为 0 .5 96(RAPD)和 0 .5 11(ISSR) ,其间产生了相当程度的遗传分化。对比RAPD和ISSR在PCR反应中的稳定性和检测变异的能力表明 ,对于实验条件的稳定性而言ISSR优于RAPD ,且总的来说ISSR能检测到比RAPD更多的遗传变异。Mantel检测表明 ,在物种水平 。

中国疣粒野生稻的分布、濒危现状和保护前景

继 1978～ 1982年全国野生稻普查后 ,又一次对中国疣粒野生稻 (Oryzagranulata (NeesetArn .ExWatt.) )主要分布点的居群特征、濒危现状和破坏情况进行了野外生态学研究。由于行政区划的改变 ,目前疣粒野生稻在中国分布的市 (县 )达 30个。它在群落盖度为 90 %～ 2 10 %下生长良好 ,具有抗旱和适应中度干扰的能力。聚集参数分析表明在群落中居群以集群分布为主。该物种主要通过重力和动物传播种子 ,居群间的基因流有限 ,形成了典型的集合种群 (metapopulation)结构。生境丧失对疣粒野生稻的生长造成非常严重的后果 ,已有 12 .9%的疣粒野生稻居群灭绝 ,83.9%的居群处于中度和重度的干扰之下。由于各地区的破坏程度不平衡 ,目前疣粒野生稻的分布被压缩到海南省的西南部山区和云南省的澜沧江中下游、南汀河流域 ,面临热区开发的巨大威胁。研究中建立了中国疣粒野生稻的总DNA库 ,作为易位保护的手段之一和开展保护遗传学研究的基础 ;

云南疣粒野生稻34个居群遗传多样性的ISSR分析

应用13个ISSR引物对云南省分布的疣粒野生稻(Oryza meyerianaBaill.)34个居群的遗传多样性进行了分析。检测到135个多态性位点,多态性位点百分率(PPB)为80.36%。在居群水平上,基因多样性指数(H)和Shannon信息指数(I)分别为0.2666和0.4028。把云南疣粒野生稻34个居群分别按照行政区、经纬度、河流流域和海拔划分成不同类型,计算它们的Na、Ne、H、I和PPB各项数值,发现疣粒野生稻遗传多样性以思茅市最高,临沧、西双版纳次之,保山、德宏最低;太平洋水系澜沧江中下游海拔较高的疣粒野生稻居群多样性较丰富。可将云南疣粒野生稻分为两大群,一大群是思茅地区的材料,另一大群包含德宏、临沧、西双版纳地区的材料。最后讨论了疣粒野生稻种质资源保护的相关问题。

栽培稻与疣粒野生稻杂种二倍体和四倍体的鉴定及比较

利用基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)技术,对栽培稻(Oryza sativa L.)与疣粒野生稻(O.meyeriana)远缘杂种二倍体(AG)及四倍体(AAGG)进行鉴定。通过对其主要农艺性状和减数分裂的比较和分析,探讨染色体加倍对杂种的影响,明确杂种不育的原因及其利用潜力。GISH检测结果证实了杂种的真实性,杂种细胞中来自疣粒野生稻的染色体有红色杂交信号,而来自栽培稻的染色体上无杂交信号。杂种四倍体的株高、剑叶长、穗颖花数、颖壳长/宽等与二倍体相比明显增加,显示出明显的多倍体优势。二者的减数分裂也存在很大差异,杂种二倍体减数分裂过程紊乱,杂种四倍体减数分裂过程则基本正常。染色体加倍明显改善了杂种的减数分裂,但杂种四倍体仍不能结实,推测杂种的不育性很可能与核质亲和性有关。但杂种在新品种(系)或育种中间材料选育上仍具有改造和利用的潜力,无芒特性使其在芒的遗传研究及多倍体水稻芒的改造等方面同样具有重要作用。

疣粒野生稻保护、遗传特性及利用研究进展

疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill.)是稻属中保存较多原始性状特征的种类,对病害、虫害及非生物胁迫的抗性良好,尤其是高抗白叶枯病,蕴含大量优良基因,既可作为抗病、抗虫、耐旱和耐盐碱基因发掘及水稻育种的优良抗源材料,也可作为稻作高蛋白、高赖氨酸等改良稻米品质育种的优异种质资源;但疣粒野生稻(GG基因组)与栽培稻(AA基因组)亲缘关系较远,其遗传特性研究和发掘利用远落后于普通野生稻等其他野生稻。文章通过综述疣粒野生稻分类和命名、优异性状、遗传特性及其在水稻种质资源创新与利用等方面的研究进展,并探讨疣粒野生稻研究和利用过程中存在的困难,指出当前疣粒野生稻赖以生存的原生境不断遭到破坏,其生存形势已十分严峻,若现存的居群得不到有效保护,将会造成更多的资源流失;此外,疣粒野生稻基因组的复杂程度限制了其功能基因及基因家族的研究,同时增加了同源基因克隆的难度和准确度,致使疣粒野生稻有利基因的发掘和利用进程缓慢,以疣粒野生稻为亲本的育种研究非常有限。因此,今后要从以下3个方面加强疣粒野生稻研究:(1)重视疣粒野生稻的保护,加强保存、保护措施研究;(2)借助现代生物技术,包括第三代高通量测序技术、蛋白组学分析和代谢组学技术等开展疣粒野生稻优异性状调控机理研究,加强抗病、抗虫、耐旱及耐阴等功能基因的发掘。(3)加强疣粒野生稻杂交障碍和杂交后代不育研究,寻求克服杂交障碍及挽救杂交后代的方法,促进疣粒野生稻在水稻育种中的应用。

栽培稻×中国疣粒野生稻种间杂种的获得与分析

通过远缘杂交得到了栽培稻品种 IR36×中国疣粒野生稻的种间杂种 ,并对杂种植株进行了分析 .结果表明 ,栽培稻×疣粒野生稻种间杂种生长旺盛 ,分蘖力强 ;其株高、剑叶长度、穗长、颖花数及花药长度等介于双亲值之间 ;生长习性、柱头颜色、粒型和落粒性等与疣粒野生稻相同 ;穗轴有分枝、光周期敏感性则与栽培稻相似 .杂种有 2 4条染色体 ,高度不育 .同工酶分析表明 ,杂种的酶谱为互补型或杂合型 .RAPD分析显示双亲之间的多态性比例为 81.4% ,杂种的扩增带中包含亲本特有带和共有带 ,且以特有带为主 .

疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长cDNA序列克隆与分析

从已构建的疣粒野生稻消减cDNA文库中随机挑取阳性单克隆经测序得到ESTs,通过生物信息学分析,选取与泛素结合酶具有同源功能的EST以RACE技术分离克隆到1个疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长cDNA序列,命名为OmE2(Oryza meyeriana Baill.ubiquitin-conjugating enzyme),该序列长917bp,最大开放阅读框为528bp,编码的蛋白具有175个氨基酸,该蛋白的分子量为19.31kD,理论等电点为9.32。OmE2蛋白与其他物种的泛素结合酶具有高度的一致性和相似性,含有泛素结合酶活性位点的保守序列及半胱氨酸残基,且具有3个跨膜结构域,推测OmE2是一类泛素结合蛋白兼跨膜蛋白。经RT-PCR分析,OmE2基因是受白叶枯病病原菌胁迫诱导表达。这是首次从野生稻中发现可能参与疣粒野生稻胁迫信号传导和抗病应答反应的基因。

疣粒野生稻胚性悬浮细胞系的建立及其原生质体的培养和植株再生

云南疣粒野生稻的成熟种子经55℃温度处理3 d打破休眠后,在诱导培养基上诱导出愈伤组织。挑选胚性愈伤组织置于液体培养基中振荡培养,经3个月的继代培养,建立胚性细胞悬浮系。悬浮细胞经酶解、去壁后获得大量原生质体,固体包埋后添加液体培养基进行原生质体培养。在培养过程中调节培养体系的渗透压,获得小愈伤组织;经增殖后在分化培养基上诱导产生胚状体,成功得到疣粒野生稻的原生质体再生植株。

云南省疣粒野生稻资源的现状调查

利用现有资料,在2004年11-12月和2005年8月12月对云南省玉溪市、思茅市、西双版纳州、德宏州、保山市和临沧地区15个县(市)的37个疣粒野生稻居群的原生境进行了核查,并发现了两个新的居群。比较了2003年与2005年云南疣粒野生稻居群面积及密度的变化,发现在疣粒野生稻的小生存环境没有被过度干预下,疣粒野生稻可以良好地生存和繁衍。

云南普通野生稻和疣粒野生稻组织培养的研究

利用普通野生稻和疣粒野生稻去壳种子 ,诱导愈伤组织。愈伤组织用N6+ 1mg/L 2 ,4-D液体培养基进行悬浮培养继代。疣粒野生稻愈伤组织生长很快 ,每周至少继代培养 1次 ,有时甚至要继代 2次。疣粒野生稻愈伤组织继代培养 1年后分化能力仍然很强 ;普通野生稻愈伤组织继代 8个月后分化能力开始下降 ,至 10个月后分化能力完全丧失。在所用的 11种培养基中 ,N6+ 1mg/L 6 -BA + 0 5mg/LNAA诱导疣粒野生稻愈伤组织再生绿苗效果最好 ,诱导率为70 %。 1994年采集到的普通野生稻的种子 ,在本实验中 (1997年 )被用来诱导愈伤组织 ,其再生绿苗率平均仅为 4 %,比 1995年用该种子进行原生质体培养的再生率 (平均 2 3%)低 ,这可能与所用的诱导愈伤组织的种子保存时间 (3年 )太长有直接关系。

云南疣粒野生稻Oryza meyeriana Baill.总黄酮含量分析研究

疣粒野生稻(Oryza meyerianaBaill.)在云南部分地区被用作消炎草药,这种利用行为对该野生稻的生存造成了一定的影响和威胁,为了有效地保护野生稻,对疣粒野生稻是否含有消炎药用成分——总黄酮含量进行了分析。通过本研究,建立了测定疣粒野生稻总黄酮含量的分光光度法,测定了云南省疣粒野生稻2个群体31个居群及居群内单株的总黄酮含量。结果表明疣粒野生稻总黄酮平均含量低于对照银杏叶和竹叶;原生境群体总黄酮含量(1.158g/kg)高于温室群体含量(0.928g/kg),但t测验差异不显著。探讨了云南疣粒野生稻作为消炎草药的可能性和可行性,提出在重要种质资源保护和利用过程中应重视土著知识的利用。

疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME281半定量RT-PCR分析

以从疣粒野生稻受白叶枯病菌诱导所建的差减文库中筛选出的一个具有CC-NBS-LRR抗病结构域的基因(克隆号为ME281),用半定量RT-PCR法,以肌动蛋白(β-actin)基因为内参,研究疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME281基因mRNA的表达水平。通过对PCR体系中循环次数及Mg2+浓度的优化,最终建立了一个稳定、方便的半定量RT-PCR体系。通过ME281基因与β-actin基因PCR产物的灰度之比,确定ME281为诱导性表达,并进一步推测其为疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因,甚至为抗病基因。

SSR标记在疣粒野生稻和普通栽培稻中的多态性研究

利用SSR标记分析了疣粒野生稻同栽培稻IR24间的遗传多样性,并对引物扩增条带类型进行了比较分析。结果表明,在所用的159对引物中共有153对引物检测到多态性位点,占总引物数的96.8%。在2个材料中共有848个位点扩增出条带,其中扩增条带片段大小相同的有67条,占总带数的7.9%。引物扩增多态性条带可以分为扩增条带片段大小不同、扩增条带数目不同和扩增条带强弱不同3种类型。说明在栽培稻中开发的SSR标记在疣粒野生稻中发生了很大的变异,不适宜进行遗传多样性分析,但仍可以应用于疣粒野生稻进行分子标记辅助选择。

云南疣粒野生稻原生质体高效分离培养体系的建立

【目的】为云南疣粒野生稻原生质体的培养、细胞融合、细胞再分化成植株奠定基础。【方法】测定不同酶解组合及浓度、酶解时间、渗透压稳定剂浓度下云南疣粒野生稻原生质体的产量和活力,同时筛选云南疣粒野生稻原生质体分离和培养的较优条件。【结果】优化后建立云南疣粒野生稻胚性悬浮细胞系的周期可缩短至45~60 d;在纤维素酶1.5%+果胶酶0.3%+甘露醇0.6 M+MES 5 mM+CaCl(2)5 mM条件下酶解2 h,云南疣粒野生稻原生质的产量为1.45×10^6个/g·FW,活力达到90.17%,制备出的原生质体在固液培养下得到云南疣粒野生稻原生质体再生植株。【结论】建立了一套快速高效分离培养云南疣粒野生稻原生质体的体系,对研究重要植物资源、种质创新和发掘其优良基因具有重要意义。

来源于疣粒野生稻高抗白叶枯病水稻新种质遗传连锁图谱的构建(英文)

Y73是一个疣粒野生稻和栽培稻不对称体细胞杂交的后代株系,它兼具了野生稻高抗白叶枯病的特性和栽培稻优异的农艺性状。本研究以Y73和易感白叶枯病的水稻品种IR24为亲本创制了重组自交系群体,并利用该群体构建了Y73特异的遗传连锁图谱。该图谱包含155个简单重复序列(simple sequence re-peats,SSR)标记和56个序列标签位点(sequence-tagged site,STS)标记,覆盖约1 540.0 cM的水稻基因组区域,平均图距为7.89 cM。该遗传图谱的构建为水稻白叶枯病抗性和其他农艺性状相关的数量性状位点(quantitative trait loci,QTLs)的定位、重要基因的分离和分子标记辅助育种提供了基础。

疣粒野生稻原生质体再生小植株

以我国特有的疣粒野生稻成熟胚和幼穗作外植体诱导愈伤组织 ,挑选致密颗粒状愈伤组织建立胚性细胞悬浮系并分离原生质体 ,将原生质体固体包埋后添加液体培养基进行培养。在培养过程中调节培养体系渗透压诱导产生胚状体 ,成功得到疣粒野生稻的原生质体再生植株 ,对提高原生质体再生频率的途径进行了探讨。