鸭肠炎病毒强毒和疫苗弱毒鉴别诊断PCR方法的建立

为建立鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)强毒和疫苗弱毒的鉴别诊断方法,通过分析比较GenBank数据库中上传的DEV强毒株和疫苗弱毒株UL2基因核苷酸序列,分析DEV疫苗弱毒和DEV强毒在UL2基因上的核苷酸序列,利用引物设计软件Oligo 7.0,设计一组可对DEV强毒株和疫苗弱毒株UL2基因进行编码区全长扩增的特异性引物,经条件优化后建立DEV强毒和疫苗弱毒鉴别诊断的PCR方法。结果表明,DEV疫苗弱毒和DEV强毒在UL2基因上存在528bp的连续核苷酸序列缺失。优化后的PCR方法最佳退火温度为55℃,对DEV强毒和疫苗弱毒扩增片段大小分别为1 019bp和491bp;敏感性强,最低检测限为15.3pg;特异性好,对鸭源常见传染病(如番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)均无特异性扩增。

猪瘟弱毒标记疫苗候选株RecC-M1垂直传播可能性评价

为探究猪瘟病毒(CSFV)弱毒标记疫苗候选株RecC-M1在猪群中的垂直传播能力,采用二次免疫方案,以5.0×10^(3.5)TCID_(50)的RecC-M1经颈部肌肉注射接种12头后备母猪,另从试验猪场随机挑选20头按常规免疫程序以750 RID剂量给后备母猪接种猪瘟弱毒C株疫苗作为对照。接种后观察试验母猪临床症状并记录其产仔情况;首免后3、5、7、14 d采集母猪鼻拭子和肛拭子样品,并于母猪妊娠中期和分娩当日进行尾静脉采血,qPCR检测各组猪的病毒血症及排毒情况,ELISA检测猪血清中分别针对BVDV1和CSFV相应抗原的抗体水平;所有接种RecC-M1的母猪在生产当天留取2头新生仔猪(共24头)并在其吮吸初乳前安乐死后剖检,观察主要脏器大体病变情况,采集扁桃体、淋巴结、脾脏和膀胱组织用于组织病理学观察,血液样品用于猪瘟病毒抗体和核酸检测。结果表明,所有母猪免疫后均未出现临床症状,接种后2周内的拭子样品中未检测到病毒核酸,妊娠中期和分娩时血清中的RecC-M1 E2和BVDV1-E rns特异性抗体均维持在较高水平,RecC-M1接种母猪的胎均仔数、死胎数和弱仔数与对照组无显著差异。对RecC-M1接种母猪所产24头新生仔猪的剖检发现,扁桃体、淋巴结、脾脏、肾脏和膀胱均未见出血、肿大等病变;组织学结果显示,扁桃体、淋巴结、脾脏和肾脏的组织结构正常,均未见有出血性变化;仔猪血样和组织样品均无病毒核酸检出,亦未见抗体阳性。结果表明,CSFV弱毒标记疫苗候选株RecC-M1对母猪及仔猪都是安全的,不发生病毒的垂直传播,为该疫苗后选株的产业化开发奠定了基础。

兼抗4种烟草病毒病弱毒疫苗的构建与效果分析

为解决单靶标疫苗无法同时防治多种烟草病毒病的现状,以黄瓜花叶病毒Fny株系(Cucumber mosaic virus Fny,CMV_(Fny))为疫苗载体,利用重叠PCR技术在CMV_(Fny) RNA2弱毒突变体基础上以不同排列顺序插入TMV、PVY和TVBMV的部分基因组保守片段,构建了6种在本氏烟中交叉保护效果好、遗传稳定,并且对CMV、TMV、PVY和TVBMV 4种病毒均具有一定抗性的重组型病毒。6种重组型病毒对CMV单独侵染的防效均超过87%,对其他3种病毒单独侵染的防效为22.2%~46.2%,对4种病毒混合侵染的防效维持在16%~37%。本研究为烟草病毒病的防治提供了疫苗材料,丰富了植物病毒弱毒疫苗创制的实践。

黄芪多糖对鸡免疫禽传染性支气管炎弱毒疫苗免疫效果的影响

试验探究黄芪多糖(APS)对禽传染性支气管炎弱毒疫苗的免疫调节作用,以期发掘黄芪多糖用作疫苗佐剂的应用潜力。将120只14日龄蛋鸡随机分为3组,每组4个重复,每个重复10只蛋鸡,分别设置为APS+H120联合免疫组、H120疫苗组以及PBS阴性对照组。各组蛋鸡共进行3次免疫,每次间隔2周,每次鼻腔接种100μL/只。最后一次免疫14 d后经鼻腔攻毒禽传染性支气管炎病毒M41株,观察鸡的临床症状,检测肺脏和肝脏载毒量。结果显示,与H120疫苗组相比,APS+H120疫苗联合免疫能够诱导14日龄蛋鸡产生传染性支气管炎病毒(IBV)特异性免疫球蛋白G(IgG)和分泌型免疫球蛋白A(sIgA),有效保护蛋鸡抵抗同种异源毒株的攻击,蛋鸡存活率为100%。攻毒后APS+H120组蛋鸡未出现禽传染性支气管炎典型临床症状,蛋鸡生产性能未受到影响。研究表明,APS对禽传染性支气管炎H120弱毒疫苗的免疫效果具有促进作用。

牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性研究

本试验旨在评估牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性。12头4~6月龄犊牛随机分成3组,每组4头,各组分别肌肉注射牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗、牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗或疫苗稀释液,2 mL/头。试验结果表明,免疫后所有试验用牛无牛病毒性腹泻病毒引起的发热和临床症状,也不引起白细胞水平的下降;仅1头牛在免疫牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失疫苗后第7 d检测到病毒血症和鼻腔排毒,在其他时间点均为阴性。所有犊牛均无大体病理学和组织病理学变化。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因弱毒疫苗对4~6月龄的犊牛安全性良好。

罗非鱼无乳链球菌弱毒疫苗不同免疫途径最适宜免疫温度的研究

为了获得罗非鱼无乳链球菌弱毒疫苗不同接种途径最适宜的免疫温度,试验将罗非鱼(Oreochromis niloticus)饲养于4个水温(22℃、26℃、30℃、35℃)中,每个饲养水温分为4组,分别为浸泡组、注射组、口服组和空白对照组,每组40尾。浸泡组罗非鱼链球病疫苗浸泡浓度为1×10^(7)cfu/mL,浸泡时间为15 min;注射组腹腔注射疫苗,疫苗菌液浓度为1×10^(8)cfu/mL,0.2 mL/尾;口服组将疫苗均匀喷洒至饲料表面,晾干投喂,分别于试验第1,3,7天口服接种,疫苗菌液浓度为1×10^(8)cfu/mL,0.2 mL/尾。于免疫后第5,10,15天每组随机选取3尾采集血液及脏器组织,检测免疫后疫苗抗原组织分布、血清抗体水平和溶菌酶活性,计算疫苗相对免疫保护率。结果表明:注射组免疫后第5,10,15天罗非鱼脾脏组织均可检测到疫苗抗原;饲养水温为35℃时,注射组免疫后第5,10,15天血清抗体水平极显著高于空白对照组(P<0.01);饲养水温为22℃时,浸泡组、注射组和口服组血清溶菌酶活性显著或极显著高于空白对照组(P<0.05或P<0.01)。随着饲养水温的升高,浸泡组相对免疫保护率逐渐降低,22℃时为52.33%;注射组相对免疫保护率逐渐升高,与饲养水温呈正相关,饲养水温为22℃、26℃、30℃、35℃时相对免疫保护率分别为21.53%、68.25%、85.64%和90.43%;口服组相对免疫保护率先升高后下降,26℃饲养水温罗非鱼免疫效果最好,相对免疫保护率为54.51%。说明罗非鱼链球病疫苗浸泡免疫接种最适饲养水温为22℃,注射免疫接种最适饲养水温为35℃,口服免疫接种最适饲养水温为26℃。

牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗在怀孕母牛中垂直传播能力评价

本研究通过对怀孕母牛免疫牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗后检测胎牛组织中是否存在疫苗病毒,以评价该疫苗的垂直传播能力。试验将16头牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原和抗体阴性,怀孕60~90 d的母牛随机分成2组,第1组6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗;另外2头牛不做任何接种作为哨兵牛同群饲养。第2组6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗;另外2头牛不做任何接种作为哨兵牛同群饲养。母牛免疫后血清抗体转阳,BVDV抗体明显升高。免疫后第56 d剖取免疫牛的胎牛,采集胎牛脑、胸腺、肠系膜淋巴结和脾脏组织用病毒分离方法检测牛病毒性腹泻病毒。结果显示,所有怀孕母牛在整个试验期内无任何临床症状,也无流产现象。试验结束时胎牛发育良好,且未在胎牛的脑、胸腺、肠系膜淋巴结和脾脏组织中分离到牛病毒性腹泻病毒。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对怀孕母牛和胎牛都是安全的,无垂直传播。

3种非猪瘟病毒单独或混合感染对猪瘟弱毒疫苗免疫效力的影响

将 2 0头 9月龄左右猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征抗原、抗体阴性猪分成 6组 ,分别利用猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒 (PRV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (PRRSV)单独或混合感染。 7d后连同对照猪 4头 ,免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗 (HCL V) ,13d后连同 4头阴性对照猪一起攻击猪瘟石门强毒。整个试验期间分别每天测温 ,观察临床症状 ,每周采集扁桃体和血样做各种病毒抗原及抗体检测。结果表明 ,非猪瘟病毒感染 7d后 ,所有各组猪均从体内检测到了相应感染的病原 ,表明 3种非猪瘟病毒感染成功。在攻击猪瘟石门强毒后 2周 ,感染了非猪瘟病毒后接种 HCL V疫苗的 4个免疫组 12头猪除 1头外 ,11头全为猪瘟病毒 (HCV)抗原检测阳性 ,且多呈强阳性 ;而单一 HCL V疫苗免疫组在猪瘟强毒攻击后检测不到 HCV;所有 HCL V疫苗免疫猪均存活 ,而非免疫对照组 4头猪全部在攻毒 16 d内死亡。

草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的制备及其免疫效果

本文报道经筛选的ＧＣＨＶ－８４１毒株在草鱼吻端成纤维细胞系（ＰＳＦ）中进行适应性培养，弱毒驯化，细胞培养弱毒疫苗的制备，安全性观察，不同稀释度和剂量的免疫保护率测定及保存试验。ＧＣＨＶ－８４１毒株在ＰＳＦ细胞中继代驯化至５３代达到减毒目的。筛选得５３～５９代作毒种制备的细胞弱毒疫苗使用安全。用稀释１０～１０４倍的疫苗，０．１～０．３毫升／尾剂量注射草鱼，其免疫保护率均在８５％以上。生产上使用疫苗的适宜浓度和剂量是稀释１０２倍和０．２毫升／尾。冻干疫苗宜保存于４℃以下。较合适的保存期是６个月（４℃）和１８个月（－２０℃）。

猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联弱毒疫苗的研究

用TGE及PED克隆化弱毒株以1：1配比制成TGE、PED二联弱毒疫苗，毒价为107.0-7.5TCID50／0.3ml，主动免疫与被动免疫的保护率为97.7％及98％。弱毒株毒力稳定，符合制苗标准。免疫期7个月，疫苗保存期一年，疫苗接种猪对同圈饲养的非免疫猪有低效价（16～32倍）的水平感染。6个猪场的田间试验保护率为95％-98％，对紧急预防接种的防制效果更为明显。

荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验替代方法的研究与应用

【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),为猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验提供一替代方法。【方法】在猪瘟兔化弱毒疫苗基因组3′非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒株的特异性引物和一条MGB探针,并进行反应体系及反应条件优化,以及特异性、灵敏度、稳定性及符合性试验。将此方法用于部分批次疫苗厂疫苗半成品的定量检验,与兔热反应进行比较,寻求两方法的相关性。【结果】试验结果证实,CT值与模板之间呈现良好的相关性,相关系数为0.9998,扩增效率为101.14%;该方法仅扩增HCLV,不扩增HCLV以外的其它病原,显示良好的特异性;具有较高的灵敏度,能检测模板中4.35个cDNA拷贝量,比CSFV-RT-nPCR高1个数量级。将此方法应用于4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验,两只兔子均无热反应(不合格)样品共11份,FQ-PCR CT值为21.15—27.30;两只兔子一只呈现定型热,一只无热反应的样品12份,CT值为17.47—23.70;两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应(合格品)样品共11份,CT值为17.10—20.8。【结论】建立的HCLV-FQ-PCR方法能特异性的检测疫苗核酸含量,与家兔热反应测定结果存在良好的相关性,可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。

苜蓿多糖对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫效果的影响

用苜蓿多糖作为猪瘟兔化弱毒疫苗的强化剂对60日龄体重18～20 kg的仔猪进行免疫试验研究.B淋巴细胞和抗体水平监测结果表明,苜蓿多糖可使猪外周血液的B淋巴细胞增多,血清抗体水平提高.攻毒试验表明,参试的2批猪,试验组潜伏期(34～72 h和36～68 h),明显长于对照组(12～48 h和14～48 h),发热温度试验组为(40.5～40.9℃和40.6～40.8℃)低于对照组(41.4～42.0℃和41.2～41.7℃),高热期试验组为(30～96 h和46～98 h)低于对照组(72～148 h和72～146h).说明苜蓿多糖对猪瘟疫苗免疫效果具有明显的强化作用.

人工合成的法氏囊活性肽对新城疫弱毒疫苗免疫效果影响的研究

应用人工合成的法氏囊活性肽给鸡两次注射，再应用新城疫弱毒活疫苗，结果表明：应用人工合成的法氏囊活性肽后短期内能够促进法氏囊的生长发育，这种促进作用的大小与应用剂量呈正相关，对脾脏生长发育没有影响。人工合成的法氏囊活性肽能够使血清中新城疫母源抗体保持较高水平和较长时间。

法氏囊活性肽对鸡传染性法氏囊病弱毒疫苗免疫效果的影响

将不同剂量的法氏囊活性肽 (BS)冻干粉与鸡传染性法氏囊病 (IBD)弱毒疫苗混合 ,对 2 1日龄SPF鸡滴鼻点眼 ,另设免疫对照组和生理盐水对照组 ,于免疫后 7d、10d、14d、2 1d、2 8d、45d、6 0d、75d和 90d采血 ,测定AGP抗体效价 ,并于免疫后 7、14、2 1、2 8d ,每组剖杀 2只 ,计算试验组囊指数与空白对照组囊指数之比 (BBIX) ,免疫后 30d用IBD JS株攻毒。结果表明 :免疫后 7d ,0 48mgBS IBD弱毒苗组AGP抗体阳性率为 5 2 9% ,比免疫对照组高 2 5 % ,BBIX数值也稍大 ;免疫后 45d抗体水平达到高峰时 ,0 96mgBS IBD弱毒苗组的抗体效价比免疫对照组高2个滴度 ,BBIX数值也稍大于免疫对照组。 30d后攻毒 ,各免疫组的攻毒保护率均为 10 0 %。整个试验期间 ,1 92mgBS IBD弱毒苗组的AGP抗体效价及BBIX数值与免疫对照组相比差异不显著。结果表明 :BS在增强机体免疫应答、提高对法氏囊的保护及损伤后的修复作用方面与其剂量有一定的关系。

小鹅瘟病毒VP3真核表达质粒与弱毒疫苗诱导鹅体免疫应答的比较

【目的】比较小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)和弱毒疫苗免疫鹅体内的免疫应答,以期为进一步研究和阐明pcDNA-GPV-VP3免疫发生机理、免疫持续期等提供基础数据。【方法】将pcDNA-GPV-VP3和小鹅瘟弱毒疫苗分别免疫30日龄四川白鹅,用免疫组织化学方法检测免疫鹅体内GPV抗原的分布,用淋巴细胞增殖实验和间接ELISA分别检测免疫鹅的细胞免疫水平和血清抗体滴度,比较GPV基因疫苗与弱毒疫苗诱导鹅体免疫应答的能力。【结果】①弱毒疫苗组于免疫鹅的心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、胸腺、哈氏腺、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠、胰腺、大脑及注射部位肌肉均中检测到GPV抗原;基因疫苗组于免疫鹅的心、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠及注射部位肌肉中检测到GPV抗原。②弱毒疫苗免疫雏鹅外周血T淋巴细胞14 d后对ConA的反应开始增强,35 d达到最高值后下降;基因疫苗免疫雏鹅外周血T淋巴细胞OD值先下降,14 d后开始上升并高于空白质粒对照鹅和PBS对照鹅,35 d时达最大值,以后又逐渐下降,第21-63天极显著(P<0.01)高于PBS对照鹅和空白质粒对照鹅,第21-63天时极显著(P<0.01)高于弱毒疫苗免疫鹅。③弱毒疫苗免疫鹅血清抗体第3天开始高于PBS对照鹅,第28天达到最大值后逐渐下降;基因疫苗免疫鹅血清体从第14天开始高于PBS对照组,第28天达最大值,第21-217天显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于PBS和空白质粒对照鹅;基因疫苗免疫鹅血清抗体除第28天极显著(P<0.01)高于GPV弱毒疫苗免疫鹅外,其余时间与弱毒疫苗免疫鹅差异不显著。【结论】pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅后能在免疫部位皮肤、心肌和各肠段中表达并能够诱导鹅体产生良好的细胞免疫和体液免疫,基因疫苗诱导鹅体产生免疫应答的能力优于弱毒疫苗,结果为阐述pcDNA-GPV-VP3的免疫机制和临床应用提供了数据资料。

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。

应用复合多聚酶链反应方法快速鉴别伪狂犬病弱毒疫苗与野毒

本研究根据伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）共有ｇＢ和疫苗株缺失的ｇＥ基因序列分别设计并合成１对通用（ＰＢ１／ＰＢ２）和１对鉴别引物（ＰＥ１／ＰＥ２），以在我国广泛使用的疫苗株Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１及从国内外收集的野毒株Ｓ、ＳＵ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、Ｍｉｎ－Ａ、Ｓｈｏｐｅ、Ｓ（川）、ＳＬ１、１０＃、ＥＡ（鄂Ａ）ＤＮＡ为模板在同一反应管中同时扩增ｇＢ和ｇＥ基因序列建立了复合多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法。ＰＣＲ产物经２．０％琼脂糖凝胶电泳显示，从所有１１株野毒ＤＮＡ中都扩增出３７２ｂｐ和５２６ｂｐ两个片段，而Ｂａｒｔｈａ－ｋ６１只扩增出３７２ｐｂ一个片段。酶切分析证明ＰＣＲ产物是特异性的。ｇＢ基因是ＰｒＶ主要保护性抗原基因，是病毒复制必需的，强弱毒都有此基因；Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株是ｇＥ基因缺失的弱毒。所以，本实验建立的方法通过１次ＰＣＲ即可有效鉴别疫苗毒与野毒。这一方法将在今后根除伪狂犬病计划中发挥重要作用。

马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

采用PCR方法分 3段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株 (EIAVDLA)的前病毒DNA ,这 3个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组 ,PCR产物经克隆后顺次连接 ,获得 1个含有EIAV全基因 (8.0kb)的重组质粒 ,将其命名为p8.0。将此 8.0kbEIAV全基因再亚克隆到含有一完整EIAVDLA株长末端重复序列的质粒中 ,获得一含有EIAV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒 ,将其命名为p8.2 ,经核苷酸序列分析 ,证明p8.2含有EIAV前病毒的全基因。用p8.2转染驴白细胞 ,将其作为种毒进行传代 ,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶活性 ,说明在驴白细胞中由p8.2衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后 ,第 4天出现病变 ,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子 ,进一步证明p8.2具有感染性 ,笔者获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆 。

荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系

为探讨荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系,本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测。结果表明,两种检测方法存在正相关性,最低105个病毒拷贝可以使家兔产生定型热反应,最低103个病毒拷贝可以使家兔产生轻热反应。荧光定量RT-PCR检测方法的检测过程仅需3.5 h,大大缩短了猪瘟疫苗的检测时间,该方法可以补充传统的兔体定型热反应用于猪瘟兔化弱毒疫苗半成品与成品的检验。

RT-LAMP可视化检测猪瘟病毒及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗

【目的】建立可视化检测猪瘟病毒(CSFV)及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),为临床检测CSFV野毒株及特异性鉴别HCLV毒株提供技术支持。【方法】根据Gen Bank中CSFV非结构蛋白NS5B基因的保守序列,设计两套针对CSFV和HCLV的特异性引物,并优化RT-LAMP反应条件,同时用LA-320C浊度仪实时监测其浊度变化。【结果】优化的RT-LAMP仅需在63℃水浴锅中反应50 min即可完成检测,且能通过肉眼观察反应液的颜色变化直接判定结果;所有CSFV样本的检测结果均为阳性(翠绿色),其他非CSFV样本的检测结果均为阴性(桔红色),且能特异性鉴别HCLV毒株,与实时浊度监测结果一致。该方法对CSFV和HCLV的最小检测限分别是100和101 copies,敏感度分别是常规RT-PCR的100倍和10倍。【结论】建立的RT-LAMP特异性强、灵敏度高、方法简便,尤其适合基层进行CSFV感染的快速检测及特异性鉴别HCLV,对有效防控CSF具有重要意义。