鉴别伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒荧光定量PCR方法的建立

根据猪伪狂犬病病毒（PRV）gH、gE基因的序列，设计了两对引物及其对应的TaqMan探针，通过对引物、探针、Mg2＋的浓度和样品DNA提取方法等进行优化，建立了鉴别PRV野毒与疫苗毒感染的荧光定量PCR方法。该方法线性范围为10^1-10^8拷贝／μL，达8个数量级，灵敏度可达10^1拷贝／μL，比常规PCR高100倍。用此方法对60份疑似组织样品进行检测，并与血清中和试验、常规PCR相比较，结果显示该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能对样品进行定量检测等优点，并且该法以闭管的模式操作，减少了后续步骤污染的可能性，整个PCR检测过程不到2h。此方法的建立，为猪伪狂犬病病毒的早期鉴别诊断和定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础。

广西猪瘟流行毒与C-株疫苗毒gp55(E_2)主要抗原区DNA序列差异的比较

采用反转录 PCR(RT- PCR)和套式 PCR(nest Polym erase Chain Reaction,n PCR)扩增出 3株广西省近期 (1999～ 2 0 0 0年 )猪瘟流行野毒的 E2 基因 ,将其分别克隆于 PMD- 18T载体上并进行了核苷酸序列测定 ,根据 C株及 Brescia和 Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行氨基酸序列推导 ,同时进行了同源性比较及 E2 糖蛋白结构的分析。结果表明 ,所测 3株 HCV E2 基因的长度均为 1170 bp,编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和部分跨膜序列 ,共由 384个氨基酸组成。3株流行毒的 E2 基因核苷酸序列同源性为 90 .10 %～ 98.5 4%,相应的氨基酸序列同源性为 89.5 9%～ 97.92 %。这 3株流行毒与 C-株兔脾组织毒 (疫苗种毒 ) E2 基因的核苷酸序列同源性为 82 .87%～ 83.99%,相应的氨基酸序列同源性为 86 .98%～ 90 .10 %,表明近期猪瘟流行毒与 C-株疫苗毒的 gp5 5蛋白之间存在一定的差异。

小反刍兽疫病毒野毒与疫苗毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

对GenBank中的小反刍兽疫野毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)及疫苗毒株的基因序列进行分析,设计两对引物和两条特异探针,建立小反刍兽疫病毒野毒与疫苗毒株的双重荧光RT-PCR鉴别检测方法。特异性检测表明,建立的双重荧光RT-PCR方法,可特异检测野毒(FAM通道)和疫苗毒(VIC通道)。灵敏度实验表明,FAM通道可检测到10^(-5)稀释度的RNA(3.576 ng/mL),VIC通道可检测到10^(-3)稀释度的RNA(27.6 ng/mL)。重复性实验表明,该双重荧光RT-PCR方法重复性较好。用建立的二重荧光RT-PCR方法对20份组织样品进行检测,结果显示,该方法可以有效区分野毒和疫苗毒株,且野毒检测结果与实验室确诊阳性结果一致,可以用于临床检测。

鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的单一与二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)临床样本快速、简便的检测技术,以区分猪瘟(classical swine fever,CSF)野毒和疫苗毒感染,为规模化猪场CSF净化奠定基础。通过对GenBank中CSF野毒、疫苗毒及近源病毒的基因组全序列比对,发现CSF兔化弱毒疫苗株3′-NTR独立存在富含T的插入序列,根据这一特点分别在该插入序列的上、下两端设计2对单一RT-PCR引物并选择特异保守区域设计了二重RT-PCR引物,优化筛选能够鉴别CSF野毒与兔化弱毒疫苗的PCR反应条件,建立了能鉴别CSF野毒和疫苗毒的单一与二重RT-PCR鉴别诊断方法。敏感性和特异性分析表明,单一RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为2.2pg(单一RT-PCR中的1对引物)和1.7pg(单一RT-PCR中的另外1对引物);二重RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为8.2pg(CSF野毒)和6.7pg(CSF疫苗毒),两种方法均检测不到PRV、PRRSV、JEV、BVDV、PCV2的DNA/RNA。采用该方法对146份可疑临床样品进行检测,结果表明CSF疫苗毒与野毒在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的二重感染率分别为6.3%、7.4%、8.3%、8.6%。本研究建立的单一与二重RT-PCR方法都具有敏感性强、特异性优、重复性好的特点,该研究对规模化猪场猪瘟的净化具有十分重要的参考价值。

肾综合征出血热灭活疫苗毒株L99株的全基因序列分析

目的 了解我国肾综合征出血热疫苗生产毒株Ｌ９９株的分子特征及抗原性的分子基础。方法 设计出不同的引物，用ＰＣＲ方法提取细胞总ＲＮＡ，逆转录扩增产物纯化后克隆Ｔ载体，纯化后测序，序列用ＤＮＡＳ ＴＡＲ软件拼接，并对其序列进行分析。结果Ｌ９９株全基因组由Ｌ片段６５３３个，Ｍ３６５２个，Ｓ１７６４个核苷酸组成， 分别编码２１５１、１１３３、４２９个氨基酸，Ｌ９９与同型病毒间同源率高达９５．５％－９９．４％。结论 为研究疫苗毒株的生物 学特性、致病机理等提供了分子基础。

小反刍兽疫疫苗毒株与强毒株的鉴别性荧光RT-PCR检测方法的建立

对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行分析,设计引物与探针,建立PPRV通用型与Ⅱ系疫苗毒特异型二重实时荧光RT-PCR方法,同时建立针对PPRVⅣ系强毒株的特异型荧光PCR方法。特异性试验和灵敏度试验表明:建立的二重荧光RT-PCR方法可特异性检测PPRV病毒,其HEX信号通道(通用型)和TAMRA信号通道(Ⅱ系疫苗毒特异型)的检测灵敏度分别可达101TCID50/mL和102TCID50/mL,完全满足PPRV的检测要求。用二重荧光RT-PCR方法对西藏采集的14份羊血清样品进行检测,并用建立的Ⅳ系强毒株特异型荧光PCR方法对二重荧光RT-PCR的检测效果进行评估,结果显示,该方法可有效甄别PPRV强毒株和疫苗毒株,避免假阳性结果的出现。

AsiaⅠ型口蹄疫病毒灭活疫苗毒株不同宿主系传代中VP1基因的遗传变异研究

口蹄疫病毒结构蛋白VP1参与构成病毒粒子的主要中和抗原位点,是4种结构蛋白中最易发生变异的。在病毒传代过程中,对VP1基因进行遗传变异分析是口蹄疫疫苗研制中不可或缺的环节。为此,作者扩增了经不同宿主系（乳鼠、BHK21细胞）连传不同代次的AsiaⅠ型毒株的VP1基因,并对其进行遗传变异分析,毒株间核苷酸同源性为99.4%-99.8%,推导氨基酸序列同源性为98.6%-100%;制苗毒株经过不同宿主系有限传代后,与传代前的原毒（MF1）相比,VP1基因未发生大的变异,主要抗原位点较稳定,说明以此种方式获得的制苗毒株制备的灭活疫苗是稳定的,适用于该毒株流行区域内相关家畜的免疫预防。

鉴别猪伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒双重PCR检测方法的建立

依据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)基因序列,分别设计了g E和g H两对引物,以PRV闽A株、Bartha(g E-)株和Norden(Tk-)株为模板,筛选最佳反应条件,建立了检测猪伪狂犬病病毒野毒株与疫苗毒株的鉴别PCR方法。该方法能从PRV闽A株、Norden(Tk-)株中扩增出一条355 bp的条带,但Bartha(g E-)株没有扩增出该目的条带。对正常细胞、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应。在对单项PCR反应条件(引物浓度、Mg^(2+)浓度、退火温度等)优化的基础上,建立了鉴别猪伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒的双重PCR检测方法,并分别用双重PCR和单项PCR检测15份临床病料,两者符合率为97.5%,表明该双重PCR检测方法有较高的敏感度,可以用于临床病料的检测。

单克隆抗体在甲肝减毒活疫苗毒种检定中应用

目的 利用单克隆抗体代替常规的人、猴免疫血清进行甲型肝炎减毒活疫苗毒种外源因子检查及鉴别试验。方法 选择适宜的单克隆抗体浓度与甲肝病毒进行中和试验 ,观察单克隆抗体的中和作用 ;利用单克隆抗体中和毒种 ,进行外源因子检查 ,并应用于鉴别试验。结果 此单克隆抗体可中和 10 5细胞培养半数感染量 (CCID50 )甲肝病毒 ,比人、猴免疫血清的中和能力高约 10 0倍 ;将此高效价的单克隆抗体中和毒种后进行血吸附及非血吸附外源因子检查 ,结果均为阴性 ;此单克隆抗体还可用于毒种鉴别试验。结论 此高效价的单克隆抗体可代替人、猴免疫血清应用于毒种的外源因子检查及鉴别试验。

IBD试纸对中等毒力疫苗毒及标准强毒的检测试验

应用IBD快速检测试纸和琼脂凝胶免疫扩散试验(AGIDT),对不同疫苗免疫鸡检测结果均为阴性,对人工感染强毒鸡最早检出IBDV的时间,试纸检测法为感染后36h,琼脂扩散检测法为感染后96h。试纸检出的最低含毒量为800ELD50,ELISA检出的最低含毒量为400ELD50,琼扩检出的最低含毒量为2 5×104ELD50,试纸检出的敏感性比琼扩提高32～64倍。IBD试纸检测简便、快速、敏感、特异,是诊断鸡法氏囊病的有效方法。

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx与疫苗毒Gt在鸡体内的复制研究

本试验利用鸡传染性法氏囊病超强毒Gx及其致弱疫苗毒Gt为对象,研究超强毒与弱毒株在鸡体主要免疫器官内的复制情况,以探讨两类毒株表现不同生物特性的原因。分别利用鸡胚半数致死量和鸡胚成纤维细胞半数感染量对超强毒Gx和疫苗株Gt进行病毒滴度的测定;再利用荧光定量RT-PCR对两类毒株进行病毒量的校准。以相同量的病毒对2周龄SPF鸡进行攻毒。攻毒试验表明超强毒Gx能造成47.5%的死亡,法氏囊、脾脏、胸腺等免疫器官均严重损伤;而疫苗毒Gt无致死,且未能造成任何病理可见的损伤。病毒的体内复制情况表明超强毒相对于疫苗毒复制更为迅速,病毒载量更高。

如何应对非洲猪瘟“野疫苗毒”?

我国养猪人经过两年多与非洲猪瘟的正面交锋,逐步总结了一整套行之有效的防控非洲猪瘟野毒株的经验,非洲猪瘟野毒株的防控已不再是困扰猪场的主要技术瓶颈。许多猪场通过对生产各环节的严格管理和监控,有效切断了非洲猪瘟的传入;即便是病毒不慎传入猪场,通过及时发现、及时确诊、果断剔除等技术,可以将猪场的损失控制在较小范围内。

疫苗毒株的数量控制是蓝耳病防控的关键

一、猪蓝耳病流行情况 猪蓝耳病病毒（PRRSV）主要分两类,高致病性毒株（变异毒株）和经典毒株,国内还是以高致病性毒株为主,据测算,其实验室检测到的90%以上的蓝耳病毒株都属于高致病性毒株。

CDV疫苗毒在Vero细胞内包涵体形成规律的研究

采用Vero细胞生产CDV(犬瘟热)弱毒疫苗是目前国内外生产CDV疫苗的主要方法。若提高CDV疫苗的效价,必须掌握细胞株的选择、培养方法、收毒时间、疫苗的保存及疫苗的使用时机。为了把好疫苗的培养及收毒时间关,我们进行了CDV疫苗毒在Vero细胞内生长规律的试验。CDV病毒可在细胞内产生包涵体,用G和HE染色后在普通显微镜下即可进行检查。本试验结果表明,CDV疫苗毒在Vero细胞中生长。

疫苗毒株胚蛋成活性检测方法研究

针对人工光照法在生物疫苗毒株(胚蛋)成活性检测中,存在劳动强度大、效率低、准确性差的缺点,提出了一种仿生胚蛋成活性图像无损检测方法。针对以往研究中胚蛋图像上下灰度不一、胚蛋蛋壳质量不一等因素影响胚蛋血脉提取的问题,提出了一种基于最小类内指数方差的自适应阈值图像处理方法。通过对去噪后的胚蛋图像进行图像边缘检测及数学形态学处理,准确构建了成活胚蛋主血脉二值形态,通过计算胚蛋内主血脉二值面积百分比判定胚蛋成活性。对胚蛋图像进行识别实验,结果表明,该系统识别一枚胚蛋用时0.093 s,胚蛋活性判定准确率为100%,可满足灭活疫苗、冻干疫苗生产的活性准确率要求。

鸡马立克病病毒强毒与疫苗毒PCR鉴别检测方法的建立

在Ⅰ型马立克病病毒（MDV）基因组中针对132 bp串联重复序列的两侧合成一对引物,应用PCR技术对临床病例采集的疑似马立克病肿瘤病变鸡肝组织和1日龄接种CVI988弱毒疫苗的健康雏鸡羽髓样本进行检测。结果表明,从临床病例采集的10份肝脏组织,7份扩增出一条314 bp的条带,相当于2个拷贝数的132 bp串联重复序列;在接种疫苗健康雏鸡的羽髓样本中,扩增出与CVI988弱毒一致的PCR图谱,相当于6个~8个或更多拷贝数的132 bp串联重复序列。根据PCR图谱的差异即可鉴别MDV强毒株与CVI988疫苗弱毒株。