高效液相色谱法测定疫苗菌体破碎液中D-核糖的技术研究

文章以示差折光为检测器,建立高效液相色谱法定量测定疫苗菌体破碎液中D-核糖的方法。该方法的测定条件为:色谱柱为安捷伦ZORBAX NH2氨基色谱柱,流动相为0.005 mol/L的稀硫酸溶液,柱温为50℃,进样量为20μL。D-核糖检测方法保留时间为3.684 min,得到的D-核糖的线性回归方程式为y=194.037 72x+10.834 09,相关性为0.999 99。式中,y为D-核糖的质量浓度;x为对应的峰面积。该方法精密度、稳定性和重现性表现良好,D-核糖的回收率范围为90.2%~102%,灵敏度高,能实现目标峰与杂峰的有效分离,因此可被广泛用于疫苗菌体破碎液等样本中D-核糖浓度的测定。

鸭大肠杆菌血清型分析和疫苗菌株的筛选

目的分析鸭大肠杆菌的血清型分布,并进行疫苗菌株的筛选。方法近年来从山东、河北等地区的商品鸭场送检的病料中分离大肠杆菌,并进行血清型鉴定和生物特性分析;通过毒力检测和免疫原性试验筛选疫苗菌株。结果共分离到44株鸭大肠杆菌。根据菌体抗原O进行分型,共鉴定血清型有6种:O78、O93、O76、O2、O92和O32;其中O78为优势血清型,占56.8%(25/44);O93血清型次之,占15.9%(7/44)。免疫原性试验证实O78血清型菌株SD具有较强的毒力和良好的免疫原性。结论分析地区的鸭场鸭大肠杆菌以O78、O93、O76为优势血清型;免疫原性较好的SD菌株可作为下一步研制灭活疫苗的候选菌株。

多组分重组减毒沙门疫苗菌对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用

目的 利用人类幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)感染的小鼠模型研究多组分重组减毒沙门疫苗菌对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用。方法 将二级C5 7BL/ 6小鼠随机分成 6组 ,通过灌胃方法分别给予生理盐水 (A组 )、PBS(B组 )、减毒鼠伤寒沙门菌SL32 6 1(C组 )、重组减毒鼠伤寒沙门菌pTrc99A -ureB +pGSTag -katA(D组 )、重组减毒鼠伤寒沙门菌pTrc99A -ureB +pTrc99A -HPaA(F组 )及重组减毒鼠伤寒沙门菌 pTrc99A -ureB +pGSTag -katA +pTrc99A -HPaA(F组 )。免疫后 4周 ,予Hp进行攻击 (A组不攻击 )。攻击菌量 10 7CFU/只 ,灌胃 2次 ,每日 1。再 4周后处死动物 ,取胃组织分别行尿素酶试验、改良Giemsa染色及定量细菌培养 ,观察Hp定植情况。行HE染色观察胃粘膜组织炎症情况。取脾组织行淋巴细胞增殖试验。结果 A组小鼠Hp定植密度为 0 ,B组为 9 4 9× 10 6CFU/ g胃组织 ,C组为 1 4 2× 10 6CFU/ g胃组织 ,D组、E组和F组小鼠分别为 2 92× 10 5CFU/g、5 5 1× 10 5CFU/g和 2 16× 10 5CFU/g胃组织 ,C组、D组、E组和F组与A组和B组相比定植密度均明显降低 (P <0 0 5 )。免疫组与对照组胃粘膜均无明显炎症反应。免疫组脾淋巴细胞增殖试验阳性。结论 口服多组分重组减毒沙门疫苗菌对小鼠Hp感染具有一定免?

不同培养条件对基因工程疫苗菌抗原蛋白表达的影响

基因工程菌的表达条件研究在现代生物高技术产业化的发展中具有重要的意义 .影响基因工程菌表达的因素主要有 pH值、温度、诱导剂IPTG的浓度、诱导时间等 .笔者分别就以上因素对基因工程菌抗原蛋白表达的影响进行了初步研究 .在摇床培养条件下 ,外源基因表达蛋白的最适表达条件为终浓度 0 .8mmol/L的IPTG ,32℃ ,诱导 6h .

不同培养条件对基因工程疫苗菌生长的影响

基因工程菌的生长条件研究在现代生物高技术产业化的发展中具有重要的意义.影响基因工程菌生长的因素主要有培养基组分、温度、pH值、溶氧量等.笔者分别就以上因素对基因工程疫苗菌株生长的影响进行了研究.结果表明该基因工程菌株的最适生长条件为37℃,进口LB液体培养基,pH8.0,200r/min,50mL锥形瓶装20mL培养基.

羊布鲁氏菌M_5疫苗菌株OMP25基因的扩增和序列分析

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患传染病，不仅严重影响养殖业的发展，而且危害人类的健康。目前辽宁省对于动物布鲁氏菌病的净化主要是采取以扑杀为主，免疫为辅的方法。鉴于现在还没有区别免疫抗体和感染抗体的有效方法，因此建立一种针对免疫动物是否感染的检测方法迫在眉睫。本文利用PCR方法对布鲁氏菌检测方法进行了探索，并对反应条件进行了优化。

表达ureB/hlyE融合蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌预防幽门螺旋杆菌感染

目的:建立表达幽门螺杆菌(H pylori)尿素酶B亚单位(UreB) 与血溶素E(hlyE)融合蛋白的减毒沙门疫苗菌,并利用H pylori小鼠感染模型,研究该疫苗菌对H pylori感染的免疫保护作用. 方法:利用分子克隆技术构建携带ureB/hlyE融合基因的重组原核表达质粒pTrc99A—ureB/hlyE,经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列,并与GeneBank中相关序列进行同源性比较.pTrc99A—ureB/hlyE转化减毒伤寒沙门菌SL3261, 培养后筛选阳性菌落,抽提质粒进行PCR及酶切鉴定.表达的UreB/hlyE融合蛋白SDS—PAGE电泳和Western-blotting 进行鉴定,薄层扫描分析蛋白含量.实验小鼠随机分成4组, 分别灌胃给予生理盐水组、减毒鼠伤寒沙门菌SL3261组、携带pTrc99A—ureB的SL3261组、携带PTrc99A—ureB/hlyE 的SL3261组.免疫后4 wk,予H pylori 107 CFU/只进行攻击(生理盐水组不攻击).攻击4wk后处死动物,取胃组织分别行改良Giemsa染色及定量细菌培养,观察H pylori定植情况. 结果:核苷酸序列测定及同源性分析证实,原核表达质粒pTrc99A—ureB/hlyE中所含的H pylori—ureB及hlyE基因与GeneBank中的H pylori-ureB和hlyE基因同源性分别为97.42% (1 663/1 707)、99.78%(910/912).重组减毒沙门氏菌可表达约100 ku的融合蛋白UreB/hlyE,含量占全菌体蛋白含量的15%;表达的融合蛋白能与小鼠抗H pylori血清特异性反应,具有良好的免疫原性.动物实验证实,疫苗组同空白对照组和SL3261组相比,H pylori定植密度明显下降,有显著性差异(P<0.05).表达UreB/hly蛋白的疫苗株组同表达UreB蛋白的疫苗株相比,H pylori定植密度明显下降,差异有统计学意义(P<0.05). 结论:重组疫苗菌对小鼠H pylori感染具有一定免疫预防作用,hlyE可以增强疫苗株的免疫保护效果.

布鲁菌病活疫苗菌体高密度发酵工艺研究

在GMP原则的指导下,为了提高布鲁菌病活疫苗的产量和头份数,在500L发酵罐基础上,对布鲁菌S2株的菌体高密度发酵工艺进行了一系列优化试验,各项发酵培养条件经优化后,菌体的密度得到了明显提高,发酵菌数可达到300亿CFU/mL以上。

利用大蜡螟幼虫和小鼠感染模型筛选猪链球菌血清2、3和9型三价灭活疫苗候选菌株

旨在评估临床分离的猪链球菌血清2、3、9型强毒株制备的三价灭活疫苗对小鼠的免疫保护效果。使用大蜡螟幼虫感染模型和小鼠感染模型,从临床分离的猪链球菌中筛选出血清2、3和9型强毒株各1株(SS1803、SS1803024、SS1696),检测其生长曲线和毒力因子。将菌株分别灭活及混合灭活后与佐剂混合,用4×10^(7)CFU、8×10^(7)CFU SS1803、2×10^(8)CFU、5×10^(8)CFU SS1803024、1×10^(8)CFU、5×10^(8)CFU SS1696及三价灭活苗(2×10^(7)CFU SS1803^(+)1.5×10^(8)CFU SS1803024^(+)3×10^(7)CFU SS1696)分别对BALB/c小鼠进行两轮免疫,采集血清检测特异性抗体水平,分别用3种菌株致死剂量攻毒后观察小鼠免疫保护率,同时用亚致死剂量攻毒三价苗免疫组,测定小鼠血、脑、肺、脾的组织载菌量和细胞因子IL-6、IL-12水平,并观察脑、肺、脾、肾中的组织病理变化。结果显示:3株疫苗候选菌株的毒力基因鉴定分别为SS1803:gapdh^(+)/sly^(+)/fbps^(+)/orf2^(+)/mrp^(-)/89K^(-)/gdh^(+)/epf^(+),SS1803024:gapdh^(+)/sly^(+)/fbps^(+)/orf2^(+)/mrp^(-)/89K^(-)/gdh^(+)/epf^(-),SS1696:gapdh^(+)/sly-/fbps^(+)/orf2^(+)/mrp^(-)/89K^(-)/gdh^(+)/epf^(-)。单价和三价疫苗免疫组均能产生对应免疫血清型的IgG抗体,以产生IgG1型抗体为主。三价疫苗免疫组能对2、3、9型3个菌株攻毒分别提供83.3%、66.7%和66.7%的保护率,能显著降低感染后小鼠组织中的载菌量,降低血清炎性因子水平和组织病变程度。本研究筛选临床流行率高的2、3、9型强毒株,联合制备三价灭活疫苗,能够对小鼠提供良好的免疫保护力,为猪链球菌多价疫苗的研发提供新的材料。

布鲁氏菌A19株菌影疫苗的构建及其免疫效果评价

为开发一种安全有效的布鲁氏菌疫苗,解决现有A19、S2和M5等弱毒疫苗存在较强毒力可感染人,且无法通过血清学方法将其免疫抗体与野毒感染抗体进行鉴别区分的问题,本试验将含有噬菌体PhiX174裂解酶基因E的质粒转化至A19疫苗株,构建菌影疫苗(A19-BG)菌株,并检验其遗传稳定性及对小鼠的安全性、免疫效果和保护效果。结果显示,构建成功的A19-BG菌株传代20代仍稳定,热诱导48 h后可完全灭活,菌体穿孔明显。A19-BG疫苗免疫小鼠7 d后免疫部位无不良反应,14 d后脾脏无可见病理变化,与空白对照组相比脾脏重量无显著差异(P>0.05)。一免和二免后14 d,免疫小鼠的布鲁氏菌抗体、白细胞介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平持续升高,产生了良好的体液和细胞免疫反应。布鲁氏菌2308强毒株攻毒免疫小鼠,免疫保护率可达87.5%,保护效果良好。结果表明,构建的A19-BG疫苗具有良好的稳定性、安全性、免疫效果和保护效果,有望成为一种极具潜力的布鲁氏菌新型疫苗。

六种布鲁菌病疫苗对绵羊与山羊免疫效果的比较

为了比较不同布鲁菌病疫苗对乌拉特草原以放牧为主的山羊与绵羊的免疫效果,我们在乌拉特草原6个苏木/镇,随机选取80~100日龄并经过布鲁菌病检测阴性的乌拉特土种绵羊羔385只、二狼山绒山羊羔275只,用6种布鲁菌病疫苗进行免疫效果比对试验。采用琥红平板凝集试验(RBPT)和试管凝集试验(SAT)分别对试验组羊接种疫苗后7、14、21、35、60、120、150、180、210、240、270 d进行转阳率和抗体效价检测;免疫后270 d进行攻毒试验。RBPT和SAT结果显示,M5-90Δ26和S2接种绵羊与山羊后抗体产生快,持续时间长;免疫后攻毒试验结果显示,A19点眼绵羊和A19-ΔVirB12株皮下注射绵羊保护比例均为4/6;M5-90Δ26绵羊皮下注射和ReV.1山羊点眼的保护比例均为4/5;本试验为乌拉特草原建立牛羊免疫无布鲁菌病区筛选理想疫苗,以及为创建全国首个牛羊免疫无布鲁菌病区制定合理的免疫程序提供了科学依据,同时对布鲁菌病疫苗的研制及国内其他地区布鲁菌病防治具有参考价值和指导作用。

林麝出血性肺炎病原菌的分离鉴定和菌影疫苗的制备

为了科学有效防控林麝出血性肺炎,本试验对发生出血性肺炎的死亡林麝进行病理剖检,采取病变肺脏进行细菌分离纯化、生化和16S rRNA测序鉴定及耐药性检测,并制备菌影疫苗开展小鼠免疫保护试验。结果显示,从表现典型出血性肺炎病变的林麝肺脏样本中分离鉴定出3株大肠杆菌,分离株对小鼠均有致病性,药敏试验均为多重耐药菌株;采用0.4 mg/mL氢氧化钠溶液裂解大肠杆菌分离株制备菌影疫苗,以0.5×10^(8)CFU/只剂量2次免疫小鼠后能提供100%的免疫保护。结果表明,从患出血性肺炎的林麝肺脏中分离到致病性大肠杆菌,制备的菌影疫苗对小鼠具有良好的免疫保护效果,为林麝大肠杆菌性出血性肺炎的防控提供了新思路。

肠毒素大肠杆菌攻毒小鼠模型的建立以及疫苗候选株保护效果的评价

目的:建立肠毒素大肠杆菌攻毒小鼠模型以及应用模型对疫苗候选株免疫效果进行评价．方法:通过鼻饲半数致死量(LD50)肠毒素大肠杆菌E44813,E44815和E11881A观察小鼠肺病理学变化、肺部细菌清除情况变化,建立肠毒素大肠杆菌鼻饲小鼠模型;应用鼻饲小鼠模型观察疫苗候选株FE1,FE3,FE6保护效果．结果:鼻饲LD50剂量肠毒素大肠杆菌小鼠的病理特征是肺组织存在大量的淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和浆细胞,为多病灶支气管肺炎,肺部细菌清除缓慢,至第7天仍能检测到105数量级的细菌．应用疫苗候选株免疫后进行攻毒,小鼠没有发病和死亡,病理特征主要是淋巴细胞少量增多,肺部细菌清除迅速,至第7天已检测不到细菌,与对照有显著性差异(0 CFU／g vs 6．2×105,5．4×105,2．3×105 CFU／g,P<0．05)．结论:肠毒素大肠杆菌鼻饲小鼠模型能够为疫苗筛选和评价提供了有效途径,同时也证实了疫苗候选株FE1,FE3,FE6具有良好的免疫保护效果．

人用皮内注射布氏菌活疫苗毒理及药效学研究

目的 研究人用皮内注射布氏菌活疫苗的毒理及药效学作用,以评价其可行性.方法 对布氏菌活疫苗进行小白鼠急性毒性试验、局部刺激试验、全身过敏试验、长期毒性试验及豚鼠皮肤变态反应试验并免疫小鼠,进行血清抗体检测.结果 小鼠皮内注射布氏菌活疫苗的最大耐受量为1.0×10^9个菌,用布氏菌素注射足底,可引起明显的迟发型变态反应.局部刺激试验,只有注射1.0×10^9个菌的部位会在48 h后化脓,但在1～2周内可自愈.全身过敏试验均未出现任何异常反应,毒性试验、各项血常规、血生化检查均未见显著差异,各脏器组织的病理学检查亦未见病理改变.免疫12周后,对豚鼠骨髓造血细胞亦无影响.对皮内免疫12周的豚鼠作背部皮肤变态反应试验,24～48 h结果为阳性.皮内免疫小鼠14 d后可测得小鼠体内有抗体产生,50 d后测得小鼠体内抗体均呈强阳性,对照组小鼠14 d与50 d抗体检测均为阴性.结论 毒理和药效学试验结果显示,布氏菌活疫苗用皮内注射的途径进行免疫是可行的.

3种免疫途径下迟缓爱德华菌菌蜕疫苗对欧洲鳗的免疫保护效果

为了探讨迟缓爱德华菌菌蜕疫苗预防鳗鲡爱德华菌病的可行性,实验采用腹腔注射、口服、浸泡3种途径探讨了迟缓爱德华菌菌蜕疫苗对欧洲鳗的免疫保护效果。结果表明,免疫后欧洲鳗血清抗体效价均明显升高,但菌蜕疫苗(ETG)组与福尔马林灭活疫苗(FKC)组间血清抗体效价无显著性差异。欧洲鳗注射、口服、浸泡ETG组的相对免疫保护率分别为75.0%、52.5%、37.5%,分别高于FKC组的55.0%、40.0%、32.5%,且ETG组欧洲鳗死亡时间明显推后,表明菌蜕疫苗的免疫保护效果优于福尔马林灭活疫苗。易操作、对鱼体应激少的ETG疫苗口服免疫欧洲鳗获得了52.5%的免疫保护率,在预防鳗鲡爱德华菌病中具有良好的应用前景。

超级细菌疫苗研究的挑战与策略

超级细菌(superbugs)泛指那些对多种抗生素具有耐药性的细菌,专业术语是'多重耐药性细菌'。2017年,WHO列出严重威胁人类的12种耐药细菌清单,金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌在清单中分别位列G^+菌首位和G^-菌前3位。因现在大部分的抗生素对它们已失去效力,全人类将面临难以承受的巨大挑战与威胁。疫苗是防控致病菌流行感染最佳的科学手段。我国科学家团队已研制国际首个靶标最多、效果最佳的金黄色葡萄球菌疫苗,正开展Ⅱ期临床试验。近20年来,欧美国家先后研发20余种超级细菌疫苗进行临床试验,但尚无一项成功。超级细菌疫苗研究面临巨大的挑战,如超级细菌致病机制不详,超级细菌疫苗如何在易感人群快速起效,超级细菌动物模型、临床流行病学基础数据和临床试验评价的关键技术及标准缺乏等均是目前超级细菌研究亟待解决的难题。我们建议今后的研究围绕以下几个方面进行:①建立保护性抗原表位大数据及高通量筛选新技术;②研究耐药菌疫苗快速起效机制及新技术;③开展超级细菌疫苗使用人群的免疫应答规律及特征研究;④建立成熟、稳定的超级细菌感染动物模型;⑤运用大数据、人工智能、基因组学等建立超级细菌流行病学大数据库和菌种资源库;⑥开展细菌疫苗的免疫保护机制及其核心指标的研究。

中华鳖温和气单胞菌口服缓释微球疫苗的研究:疫苗用菌液培养条件的优化

以中华鳖温和气单胞菌 (Aeromonas sobria,As)口服缓释微球疫苗生产菌株 Z- 1株培养菌液含菌量和胞外产物溶血性为指标 ,考察了培养温度、培养时间、振荡与否、培养基 p H等因素对 As Z- 1株繁殖和产毒的影响 ,并采用正交试验方法 ,对培养基配方进行了优化试验。结果表明 :不同的培养温度、培养时间、振荡与否、培养基 p H等均会影响As Z- 1株的菌体产量和溶血性 ,其中 2 8℃振荡 (2 0 0 r/ min)培养 36 h菌液的含菌量和溶血价均较高 ;在营养肉汤中添加适量的硫酸铜、磷酸二氢钾、硫酸锰和硫酸铵 ,可显著提高菌液的含菌量和溶血价。

布鲁氏菌A19疫苗株全基因组测序及比较基因组学分析

目的探索布鲁氏杆菌A19疫苗株全基因组的结构、分子生物学的功能,并对其生物信息学进行研究。方法采用Illumina Hiseq 4000和PacBio对A19进行全基因组测序,并与GenBank上的8株菌进行比较基因组学解析。A19基因组3286167 bp,预测3371个基因,GC含量57.25%。通过注释COG库,对应基因有2560个,将其归入22类COG中;根据比对KEGG库,得到2544个基因,共参与33类代谢通路。结果综合两个数据库结果发现,大多数A19预测基因中的基因功能主要与膜运输、氨基酸转运及碳水化合物代谢有关。结论通过分析发现,A19和猪羊牛种布鲁氏菌之间存在一定差异,并找出牛种毒力基因。本实验通过测序A19全基因组,为布鲁菌疫苗的研究提供思路。