产苦马豆素的疯草内生真菌研究进展

含苦马豆素(Swainsonine, SW)的棘豆属(Oxytropis DC.)和黄芪属(Astragalus L.)植物称为疯草,其共生着一种疯草内生真菌(Alternaria Section Undifilum oxytropis)。疯草中的SW由其内生真菌产生,而非由宿主植物产生。SW是一种吲哚里西啶类生物碱,牲畜食用疯草后引起中毒,严重者死亡,对我国畜牧业危害巨大。本文对棘豆属疯草的分类与分布,疯草内生真菌的分类、分布、传播方式及形态学差异,不同真菌中SW的合成相关酶及合成途径的研究进展进行综述,讨论了SW合成途径及其关键酶的作用,旨在为疯草内生真菌的研究、利用及SW合成途径的明晰提供参考。

产苦马豆素疯草内生真菌Alternaria SectionUndifilum oxytropis的诱变筛选

【背景】疯草是黄芪属和棘豆属有毒植物的统称,疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis是从疯草中分离获得的一种具有产生苦马豆素(swainsonine,SW)能力的真菌。因其产物SW一方面体现出良好的抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移作用及潜在的抗艾滋病病毒等多种药用活性,另一方面牛羊因大量误食疯草能导致中毒,对草原畜牧业健康发展造成了严重的危害,受到研究人员的广泛关注。但由于疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制尚不清楚,严重制约了后续通过生物发酵大量获得SW用以抗肿瘤机制研究与临床应用,以及通过基因工程手段对疯草进行脱毒育种,使疯草成为牛羊可食用、无毒的天然牧草。【目的】利用有效的研究手段,阐明Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制。【方法】以Alternaria Section Undifilum oxytropis为出发菌株,分别采用紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变的3种诱变方式,在不同诱变时间、诱变剂量等条件下对其进行了诱变筛选研究。通过测定不同诱变方式和作用条件下对菌株的致死率,经发酵培养、连续5代传代培养、并采用α-甘露糖苷酶活性分析法检测诱变菌株产苦马豆素含量变化,优化确定了不同诱变方式下最佳诱变条件,并将优势突变菌株接种马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)和改良察式液体培养基,连续培养32 d,测定并绘制了突变菌株D4和UD1的生长周期曲线。【结果】经上述3种诱变方式处理后,分别获得1株产苦马豆素含量变化较大、能稳定连续传代培养的突变菌株U4、D4、UD1。其优化的诱变条件,紫外辐照为辐照处理160 s,亚硝基胍化学诱变为亚硝基胍诱变剂量6μL、诱变处理时间5 min,紫外辐照与亚硝基胍复合诱变为紫外辐照20 s,亚硝基胍诱变剂量2μL,诱变处理时间5 min。突变菌株U4、D4、UD1较原始菌株,菌落形态偏小、中间凸起,菌落颜色呈微粉色或白色,且其产苦马豆素含量均有显著变化,其中U4突变菌株产苦马豆素量平均增加16.02%(P<0.01)、D4突变菌株产苦马豆素量平均降低23.58%(P<0.01),UD1突变菌株SW产量平均增加21.87%(P<0.01),但D4、UD1突变菌株生长周期与出发菌株一致,均为24 d。【结论】通过紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变方法,成功筛选出产苦马豆素含量变化较原始菌株差异较大的3株突变菌株U4、D4、UD1,这为后续利用高通量测序等分子生物学手段,在分子水平上阐释疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis关键基因、关键酶在其生物合成苦马豆素机制关系方面奠定研究基础。

产苦马豆素疯草内生真菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据疯草内生真菌苦马豆素合成基因簇中swnK基因KS区域设计引物,构建SYGR Green I实时荧光定量PCR检测方法,初步分析黄花棘豆植物样品中内生真菌生物量与苦马豆素含量的关系。结果表明,基于swnK基因KS区域构建的实时荧光定量PCR法特异性较好,灵敏性较高,当真菌起始DNA浓度在0.009~90ng/μL范围时,内生真菌起始DNA浓度的对数值与Ct值呈负相关,内生真菌DNA的最低检出限为0.009ng/μL。在此基础上对黄花棘豆内生真菌生物量的分析表明,苦马豆素含量与内生真菌生物量呈正比。用于疯草内生真菌生物量检测时,基于swnK基因KS区域构建的实时荧光定量PCR方法特异性要高于基于ITS序列构建的方法,其灵敏度、检测限与后者相当,可用于疯草中产苦马豆素内生真菌的定量分析。

产苦马豆素疯草内生真菌及苦马豆素研究进展

疯草(Locoweed)是黄芪属、棘豆属和苦马豆属中含苦马豆素(swainsonine,SW)有毒植物的统称,具有抗旱耐寒,分布广泛的特性。牲畜长期采食疯草会引起蓄积性中毒,严重时导致死亡,严重危害了我国草原畜牧业的可持续发展。疯草内生真菌是疯草具有毒性的根本原因,其毒性代谢产物即苦马豆素。论文对疯草在中国的种类与分布、疯草与内生真菌互作关系、疯草内生真菌种属及检测方法、疯草内生真菌传播方式与内生真菌育种;苦马豆素的来源、毒理机制及生物合成通路最新研究进展做一综述,以期为疯草植株及其内生真菌的改造利用方面提供参考。

产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis的发酵培养及苦马豆素检测方法的建立

通过对生长初期疯草内生真菌U.oxytropis菌丝复苏后连续培养32d,每隔4d取样1次,并设3个平行培养组,测定其不同培养时期菌丝干重变化,利用超声减压旋蒸法提取菌丝和发酵液中苦马豆素(SW),并分别利用薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法对菌丝、发酵液中SW含量进行测定。结果显示,经测定疯草内生真菌U.oxytropis菌丝干重质量,确定疯草内生真菌U.oxytropis生长周期为24d;薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法都可快速对菌丝和发酵液中提取的SW进行定性、定量检测,并比较3种检测方法,发现气相色谱法检测限低、灵敏度更高。本试验完成了疯草内生真菌U.oxytropis生长周期的测定,并建立了菌丝、发酵液中SW的有效、快速提取及检测方法,为下一步产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis生物合成机理的研究奠定基础。

内生真菌苦马豆素生物合成研究进展

指出了苦马豆素(Swainsonine,SW)是一种有毒的吲哚里兹啶生物碱,含有SW的棘豆属和黄芪属植物统称为疯草,牲畜过量采食疯草中毒,引起畜牧业的巨大损失。SW具有抗肿瘤和免疫调节的医学作用,但人工合成SW价格较高,因此利用生物合成SW也有重要价值。从SW来源及理化性质、作用机理、提取检测方法,疯草内生真菌SW及其生物合成途径研究进展等方面进行综述,为明晰SW合成途径、控制疯草蔓延及发挥SW的医疗作用提供参考。

沙打旺黄矮根腐病的研究进展

沙打旺仅在我国作为牧草人工栽培,20世纪末期种植面积达6.7万hm2,此后因草地快速衰退而播种面积大幅度缩减。研究发现其早衰的主要因素是一种真菌病害,该病害就是首次在甘肃发现的沙打旺黄矮根腐病,目前已在甘肃、陕西、宁夏、云南、内蒙古等所有沙打旺栽培地区发现。枝条矮化、叶片黄化、根腐烂是主要症状,病菌为沙打旺埃里砖格孢(Embellisia astragali),其菌丝寄生于植株的所有组织体内,为系统性病害。为有效防控该病害,保护我国特有牧草,自该病发现后在病害和其病原菌特点、病菌的分子生物学、抗病品种筛选、药剂防治等方面进行了研究,本研究综述了自该病发现以来的研究成果,提出了该病害在植物病理学领域的意义以及后续应加强的研究方向。

甲基磺酸乙酯诱变的棘豆链格孢菌菌株苦马豆素合成基因簇相关基因表达模式分析

旨在对棘豆链格孢菌SWN基因簇各基因表达模式与苦马豆素合成的相关性进行分析。本研究应用甲基磺酸乙酯(EMS)对棘豆链格孢菌UA003诱变处理,筛选苦马豆素产率显著变化的诱变菌株。对棘豆链格孢菌UA003、EMS诱变菌株及甘肃链格孢菌EA菌株SWN基因簇AATL、swnR、swnN、swnH1、swnH2、swnK(A、KS、SDRe1、SDR)等基因的表达水平和swnK基因的突变位点进行分析。结果表明:E02、E23和E25等诱变菌株苦马豆素产率显著增加,其AATL、swnR、swnN、swnH1及swnH2等基因表达显著下调(P<0.05或P<0.01),A、KS、SDR和SDRe1基因表达显著上调(P<0.05或P<0.01)。突变菌株E02 swnK基因13个核苷酸位点发生突变,其氨基酸序列6个位点发生突变。与UA003相比,EA菌株163个核苷酸位点不同,氨基酸序列67个位点不同,其编码产物起始段缺失一段由MLTPAVSLKNLTKPK组成的氨基酸序列,在AT基因编码产物的1135与1143处插入了一段由TEVDGVP组成的氨基酸序列。综上所述,EMS诱变处理能显著改变棘豆链格孢菌的苦马豆素合成能力及SWN基因簇各基因的表达水平。其SWN基因簇中AATL、swnR、swnN、swnH1、swnH2等基因的表达模式与苦马豆素合成呈现负相关,A、KS、SDR和SDRe1等基因的表达模与苦马豆素合成呈现正相关,EMS突变菌株苦马豆素合成的变化可能与SWN基因簇相关基因结构和功能的变化有关。