猫疱疹病毒I型核酸快速检测方法的建立及初步应用

文章根据猫疱疹病毒I型(FHV-1)基因组中序列保守稳定的TK基因设计特异性引物和探针,建立了灵敏度高、特异性好、高效的FHV-1核酸快速恒温扩增检测法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测FHV-1核酸,与猫杯状病毒、猫细小病毒及猫传染性腹膜炎(猫冠状病毒)病毒核酸无交叉反应;灵敏度高,最低可检测10 copies/反应;检测时间短,30 min即可完成反应;重复性好,各重复间cv%小于5%。用该方法对20份临床鼻拭子进行检测,与荧光定量PCR法相比,总符合率为100%。文章建立的eRDA快速检测法操作简便,尤其适合宠物医院的现场快速检测。

19种南药提取物体外抗单纯疱疹病毒I型活性研究

目的从19种南药提取物中筛选具有抗单纯疱疹病毒I型活性的成分。方法采用细胞病变效应法(Cytopathogen-ic effect,CPE)测定不同提取物的细胞毒性及抗HSV-I活性。结果从19种南药提取物中找到了5种含有抗单纯疱疹病毒I型的活性成分。结论对这5种提取物及其相关化合物的进一步研究,有希望开发出抗单纯疱疹病毒I型的新药。

单纯疱疹病毒Ⅰ型与阿尔茨海默病相关性及中药抗单纯疱疹病毒Ⅰ型感染研究进展

目的对单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus typeⅠ,HSV-1)与阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,AD)的病理关系、可能机制及中药抗HSV-1感染研究进行综述。方法检索CNKI和PubMed数据库,收集1990年1月1日至2022年5月30日中医、西医关于HSV-1与阿尔茨海默病关系研究及中药防治HSV-1研究的报道。结果HSV-1反复感染可诱导β淀粉样蛋白(βamyloid,Aβ)累积和微管相关蛋白磷酸化(Tau protein phosphorylation,p-Tau)表达增加;ApoE4基因有利于HSV-1进入大脑增加HSV-1诱发AD的风险,Aβ可能是一种诱捕HSV-1的抗菌肽;研究发现多种中药单体或复方具有较好的抗HSV-1作用。结论HSV-1感染可能是阿尔茨海默病发生发展的因素之一,其机制可能与Aβ诱捕HSV-1病毒有关,ApoE4基因增加了HSV-1诱发AD的风险,目前中药抗HSV-1感染研究已取得了一定进展,为从中药筛选抗HSV-1新药提供了有力支撑。

牛疱疹病毒Ⅰ型二重LUX荧光PCR鉴别检测方法的建立

采用LUX新型荧光PCR技术原理，建立了快速检测牛疱疹病毒I型（BHV-1）以及鉴别野毒感染和基因缺失疫苗免疫动物的二重实时荧光PCR方法。结果显示，该方法对多株BHV-1病毒均呈典型gE、gC双基因阳性反应，对其他常见动物疱疹病毒以及健康牛基因组DNA等均呈阴性反应；对细胞增殖病毒液的gE、gC双基因鉴别的检测敏感性可达0．4～O．04TCID50比常规PCR方法高100倍以上；对带毒牛血清、抗凝全血、牛新鲜精液和冷冻精液基因鉴别的检测敏感性分别达0．04TCID50、0．4TCID50、0．4TCID50和4TCID50。采用该方法从临床牛血样、鼻拭子样品中检出IBRV阳性样品，检测全程仅需约2h。对单基因克隆质粒的检测进一步证实该方法能特异地鉴定gE、gC基因，检测灵敏度分别达90、30拷贝。结果表明，该方法可应用于临床快速诊断BHV-1病毒感染，鉴别BHV-1病毒感染与对应的基因缺失疫苗免疫动物。

弓形虫SAG1和GRA4基因的原核表达及其重组猫疱疹病毒Ⅰ型转移载体的构建

为构建表达弓形虫抗原的重组猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)转移载体,本研究以pBluesciptⅡ-SK(-)为骨架载体,分别插入FHV-1 TK基因的5'(2 000 bp)和3'(1 700 bp)同源臂、pCAGGs载体中含有启动子和终止信号的表达盒以及弓形虫RH株SAG1或GRA4基因,构建重组FHV-1的转移载体pBS-TK-SAG1和pBS-TK-GRA4。将其分别转染于293T细胞,通过原核细胞表达的截短SAG1和GRA4重组蛋白制备的鼠多克隆抗体进行western blot鉴定。结果显示,制备的弓形虫SAG1和GRA4多克隆抗体能够特异性识别重组表达和虫体表达的天然的SAG1和GRA4两种弓形虫蛋白,分子量一致,分别为35 ku和45 ku。本研究为表达弓形虫RH株SAG1和GRA4基因的猫重组疱疹病毒Ⅰ型载体疫苗的研制奠定了基础。

蛋清溶菌酶对人单纯疱疹病毒Ⅰ型抑制作用的实验研究

目的:观察蛋清溶菌酶(HEWL)对人单纯疱疹病毒I型(hHSV-1)的抑制作用。方法:以HSV-1的敏感细胞BHK-21为实验细胞模型,以更昔洛韦为阳性对照药,以0.5%12-烷基磺酸钠(SDS)为阻断剂,采用细胞病变法(CPE)判定溶菌酶对hHSV-1的抑制效果。结果:HEWL对细胞的最大无毒浓度(TC0)和半数中毒浓度(TC50)均>1 000μg.mL-1,HEWL对hHSV-1抑制作用的最小有效浓度(MIC)为104.17μg.mL-1,半数有效浓度(IC50)为46.88μg.mL-1,治疗指数(TI)为10.67。在平行对照试验中,更昔洛韦对BHK-21细胞的TC0和TC50均>500μg.mL-1。更昔洛韦对hHSV-1抑制作用的MIC为7.81μg.mL-1,IC50为3.91μg.mL-1,TI为64。0.5%SDS完全阻断了HEWL的抗病毒能力。结论:蛋清溶菌酶对HSV-1有较明显的抑制作用,作用强度与溶菌酶的浓度相关。

荧光恒温扩增技术检测单纯疱疹病毒Ⅰ型RNA方法的建立

目的利用荧光恒温扩增技术(SAT)建立一种快速、可靠的单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)检测方法。方法根据Genbank上获取HSV-1开放读码框Us5区域的RNA序列设计扩增引物及优化探针,使用M-MLV反转录酶及T7 RNA多聚酶对HSV-1 RNA进行核酸扩增,同时利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪进行实时荧光信号收集和检测。收集儿童病毒性脑炎或疑似患儿样本212份(脑脊液样本150份、血浆样本62份),以巢式PCR+测序为参比方法,对SAT结果进行Kappa一致性分析。结果 SAT检测HSV-1 RNA的灵敏度为100拷贝/μL,采用SAT检测212份临床样本,共检测出18例HSV-1阳性样本,巢式PCR检出16例阳性,经测序证实其中12例为阳性结果。SAT与巢式PCR+测序方法的Kappa值为0.785,其敏感性为100.0%、特异性为97.0%。结论建立的SAT检测脑脊液和血浆中HSV-1 RNA的方法具有敏感性高、特异性强、准确、快速、可靠的优点,适用于临床对单纯疱疹病毒性脑炎早期的快速诊断。

重组牛疱疹病毒I型疫苗的研制现状

牛疱疹病毒I型(BHV-1)是牛传染性鼻气管炎的病原体。BHV-1可诱导感染的宿主产生细胞、体液和粘膜免疫应答,是一种理想的疫苗载体,可表达病毒的多种蛋白和细胞因子。以BHV-1为载体的疫苗包括:伪狂犬病毒(rBHV-gB/gC/gD/gE/gI)、口蹄疫病毒(rBHV-VP1)、牛呼吸道合胞病毒(rBHV-Gsyn)、兔出血热病毒(rBHV-VP60)、牛病毒性腹泻病毒(rBHV-E2)、细胞因子(rBHV-IL-1/IFN-γ、rBHV-IL-2/IL-4、rBHV-GM-CSF、rBHV-HDAF和BHV-IRP1)等,本文将综述这些BHV-1介导的疫苗的研制现状。

Ⅰ型单纯疱疹病毒UL30基因片段在口腔鳞状细胞癌中的分布

应用与单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶⅠ）ＵＬ３０基因片段杂交的寡核苷酸探针，对４例未转移浸润癌、４例转移浸润癌及其转移淋巴结组织进行原位杂交研究。结果发现：（１）有４例未转移浸润癌、３例转移浸润癌及其转移淋巴结组织杂交分别阳性，但阳性率无显著性差异；（２）ＵＬ３０基因片段主要位于肿瘤上皮细胞胞浆；（３）ＵＬ３０基因片段在肿瘤浸润和转移的过程持续存留在肿瘤上皮细胞中；（４）存在ＨＳＶⅠ基因片段的组织均无ＨＳＶⅠ增殖感染的形态学特征。提示ＨＳＶⅠ可能以特殊感染方式在口腔鳞状细胞癌的发生发展中起作用。

牛疱疹病毒Ⅰ型前早期基因BICPO的表达对牛免疫缺陷病毒LTR的反式激活作用

由含有ＢＨＢＶ－１（ＢｏｖｉｎｅＨｅｒｐｅｓＶｉｒｕｓ－１）前早期基因的基因组片段亚克隆ＢＩＣＰＯ（ＢＨＶ－１ＩｎｆｅｃｔｅｄＣｅｌｌＰｒｏｔｅｉｎＯ）的ＤＮＡ序列至表达载体ｐＳＶＫ３，构建质粒ｐＳＶ２．９。将该质粒与ｐＢＬＴＲ－Ｌｕｃ共转染小牛肺细胞，检测转染细胞裂解物的荧光素酶活性，ＢＩＣＰＯ的表达产物可以显著地激活ＢＩＶＬＴＲ启动子控制下的荧光素酶基因的表达。根据ｐＳＶ２．９与含有ＢＩＶＬＴＲ不同区段缺失的质粒ｐＤ－３１９－Ｌｕｃ、ｐＤ－１１５－Ｌｕｃ、ｐＤ－５２－Ｌｕｃ共转染小牛肺细胞的实验结果，推测ＢＩＶＬＴＲ－３１９位上游区的ＤＮＡ序列影响ＢＩＣＰＯ基因产物对ＢＩＶＬＴＲ表达的激活作用。

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B胞浆区编码基因的原核表达、纯化及抗体制备

目的获得高纯度的重组单纯疱疹病毒Ⅰ型HSV-1糖蛋白BgB胞浆区蛋白并制备其特异性抗体。方法从感染HSV-1的BHK细胞中提取总RNA用RT-PCR特异性扩增HSV-1gB胞浆区编码基因,经双酶切后,克隆入表达载体pGEX4T-1中,进行融合表达。以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗体,进行Westernblot鉴定。结果用IPTG诱导后,表达出相对分子质量Mr约42000的融合蛋白。用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备的抗体滴度为1400。结论获得重组HSV-1gB胞浆区蛋白及其特异性抗体,为后续功能研究奠定了基础。

从1例新型冠状病毒肺炎病例中同时分离到新型冠状病毒和单纯疱疹病毒I型

目的了解1例新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)确诊病例的病原学构成。方法将1例COVID-19确诊病例的口咽拭子、血清、鼻咽拭子的标本接种到Vero-E6细胞管进行病毒分离,每日观察细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,待CPE达75%以上收获细胞分离物,反复冻融3次后离心取上清液,应用透射电镜观察获取病毒电镜图片,同时提取病毒核酸,采用二代测序技术进行全基因组序列测序。通过序列进化分析,对获得的病毒株进行鉴定分型。结果本研究从1例COVID-19患者的鼻咽拭子中分离到1株新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV),同时在该患者的1份口咽拭子中分离到1株单纯疱疹病毒I型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)。结论COVID-19病例存在2019-nCoV和HSV-1合并感染的可能性。

曲古抑菌素A联合单纯疱疹病毒I型对U251细胞增殖、凋亡的影响

目的以体外培养的U251细胞为模型，观察曲古抑菌素A（TSA）联合单纯疱疹病毒I型（HSV-1）对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响。方法以0．5×10^-3mol／LTSA和10MOIHSV-1及0．5×10^-3μmol／LTSA与10MOIHSV-1组合作用于U251人胶质瘤细胞，72h后噻唑蓝（MTr）比色法检测各组细胞增殖情况，显微镜下观察各组细胞形态，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。结果单一TSA组、单一HSV-1组、TSA与HSV一1联合组U251细胞增殖抑制率分别为（48．0±1．8）％、（18．0±3．1）％、（58．0±5．8）％；凋亡率分别为（47．4±3．5）％、（29．6±3．0）％、（59．6±4．0）％。TSA与HSV-1联合组U251细胞增殖抑制率及凋亡率明显高于单一使用TSA或HSV-1组（P〈0．01）。结论TSA联合HSV-1对体外培养的U251细胞具有协同或叠加杀伤作用。

单纯疱疹病毒Ⅰ型载体构建在神经系统疾病治疗中的应用

Ⅰ型单纯疱疹病毒具有嗜神经特性。感染神经细胞后在神经细胞中呈潜伏感染状态,可作为神经系统疾病基因转移治疗过程中理想载体。本文就该载体构建及神经系统疾病治疗的研究做一综述。

小鼠脑无症状性单纯疱疹病毒Ⅰ型感染的实验研究

【目的】观察单纯疱疹病毒I型(herpes simplex virus-type one,HSV-1)是否可以引起脑组织的无症状性感染,探讨多发性硬化的发病机制。【方法】将Balb/c小鼠分为实验组、对照组和脑炎组,在不同时间点观察小鼠神经病学体征、行为学以及体重变化;用聚合酶链反应法检测三叉神经节病毒DNA片段;免疫荧光法检测脑组织疱疹病毒抗原表达,以判定脑组织病毒增殖性感染的存在。【结果】实验组小鼠各时相点神经病学体征、神经行为学和体重变化与对照组小鼠相比较差异无统计学意义。在病毒接种的各时相点,大部分小鼠三叉神经节检测到了疱疹病毒DNA片段,同时脑的颞叶、顶叶和额叶皮层均发现片状HSV抗原阳性表达神经元,以7 d组阳性细胞最多,荧光亮度最强,15 d组阳性细胞减少,荧光亮度减弱。【结论】单纯疱疹病毒Ⅰ型能够引发小鼠脑组织的急性、短暂性、无症状性非坏死性感染。

荔枝草提取物体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的研究

目的探讨荔枝草醇提物体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)的作用。方法体外培养HSV-Ⅰ感染兔肾细胞,给予不同浓度梯度的荔枝草醇提物,并以阿昔洛韦(ACV)为阳性对照,采用细胞病变效应(CPE)及四唑盐(MTT)比色法,观察荔枝草醇提物对兔肾细胞的毒性及对HSV-Ⅰ感染兔肾细胞的抑制作用。结果 CPE结果显示荔枝草醇提物在质量浓度为1 350μg/m L时可使细胞产生皱缩、破碎等毒性特征,在质量浓度为169μg/m L时,毒性特征消失,在半数细胞毒性质量浓度675μg/m L下能明显抑制HSV-Ⅰ。MTT法结果显示荔枝草醇提物质量浓度在21~338μg/m L范围内,细胞存活率均大于60%,当质量浓度为42、84、338μg/m L时的吸光度值均大于病毒对照组的吸光度值,差异具有统计学意义。结论荔枝草醇提物在体外对HSV-Ⅰ有一定的抑制作用。

猫疱疹病毒Ⅰ型US3基因剪接异构体的鉴定

为鉴定猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)US3基因的编码产物,本研究以提取FHV-1感染细胞的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增US3基因转录产物,测序结果显示除了全长US3基因(1 056 bp)外,还出现了一个825 bp的片段(US3-X1)。该片段是由全长US3基因在226 bp^458 bp位置发生了自我剪接,导致234 bp DNA缺失而产生,但ORF并没有改变。此外,通过重叠延伸PCR将US3基因226 bp处碱基"A"突变为"G"(m US3),改变自我剪接位点。将全长US3基因、m US3和US3-X1基因分别克隆至p3×Flag-CMV-10中,转染F81细胞,经western blot检测表明FHV-1 US3可以表达两种不同分子量的异构蛋白,大小约为45 ku和50 ku。这种US3基因的剪接异构体现象在猪伪狂犬病毒和人单纯疱疹病毒中已有报道,而FHV-1 US3基因的剪接异构体的鉴定尚属首次。该研究结果为进一步研究FHV-1 US3异构体蛋白的功能奠定了基础。

单纯疱疹病毒Ⅰ型潜伏感染的研究——兔三叉神经节致敏T淋巴细胞检测研究

报告应用抗兔致敏T淋巴细胞的单克隆抗体和ABC免疫组织化学技术对22只实验性单纯疱疹病毒性角膜炎的家兔三叉神经节致敏T淋巴细胞检测的结果。首次揭示在角膜原发感染HSV-Ⅰ过程中三叉神经节内致敏T淋巴细胞的出现。致敏T淋巴细胞在角膜接种后第13天出现,第85天消失。结果表明:T淋巴细胞在TG内HSV-Ⅰ潜伏感染的建立过程中起重要作用。本研究对指导临床治疗提供了理论依据。