柳树痂囊腔菌的基因组测序和比较基因组分析

【目的】报道柳树痂囊腔菌(Elsino?murrayae)的全基因组序列,与甜橙痂囊腔菌杨树致病型的基因组进行比较分析,为阐述柳树痂囊腔菌的致病和适应性机制提供参考。【方法】采用Illumina HiSeq 2500测序仪对柳树痂囊腔菌的全基因组序列进行测序,预测蛋白编码基因,筛选与致病相关的碳水化合物活性酶基因、小分泌蛋白基因和次生代谢产物基因簇。根据痂囊腔属真菌基因的直系同源关系,筛选柳树痂囊腔菌和甜橙痂囊腔菌杨树致病型之间共有特异性的基因和二者之间差异基因,并进行GO富集分析。鉴定柳树痂囊腔菌的交配类型位点,使用特异性引物进行PCR,检测分离株的交配类型。【结果】组装获得了1个20.7 Mb基因组,完整度99%;预测出8 256个蛋白编码基因,其中包括486个碳水化合物活性酶基因,193个小分泌蛋白基因和16个次生代谢产物基因簇(GenBank登录号:NKHZ00000000)。系统进化和共线性分析显示柳树痂囊腔菌和甜橙痂囊腔菌杨树致病型亲缘关系最近,两者之间具有12个在其他痂囊腔菌中没有的共有特异性基因。两个真菌的比较基因组分析,筛选出752和1 746个差异基因,主要参与碳水化合物代谢和毒素代谢的生物学过程。已有分离株的交配类型均为MAT1-2。【结论】获得柳树病原真菌-柳树痂囊腔菌的基因组,筛选出痂囊腔菌中负责寄主适应性的候选基因,分析了柳树痂囊腔菌交配系统,这可为柳树病害防治和柳树-病原真菌相互作用研究提供关键信息。

根癌农杆菌介导的柳树痂囊腔菌遗传转化探究

柳树痂囊腔菌是柳属植物重要的真菌病原,为了建立该真菌的遗传转化体系,本研究测试了柳树痂囊腔菌对潮霉素B、卡那霉素和草铵膦的敏感性,确定80μg/mL潮霉素B用于转化子筛选;构建了双元载体,使用构巢曲霉色氨酸合成基因启动子和柳树痂囊腔菌翻译延伸因子基因启动子分别驱动潮霉素抗性基因和GFP基因;在农杆菌介导的遗传转化中发现使用生长6 d菌落的分生孢子作为受体材料,农杆菌诱导培养基为pH=5.2,并添加乙酰丁香酮200μg/mL的条件下,柳树痂囊腔菌转化效率为0.62个转化子/10000个孢子;抗性菌落的PCR检测产生特异性条带,定量PCR结果显示外源基因高水平表达,并且在蓝色激发光下释放绿色荧光。使用反向PCR鉴定T-DNA插入位点,在2个转化子中发现插入突变的目标基因,进一步分析未在这两个突变体中发现生长发育和致病性的改变。本研究在柳树痂囊腔菌中建立了高效的根癌农杆菌介导遗传转化方法,有利于该菌的基因功能研究,并且促进痂囊腔属真菌共有致病机制的探索。

葡萄黑痘病病原菌生长特性研究

【目的】探索葡萄黑痘病病原菌在不同培养条件下的生长情况,优化其培养条件,以缩短培养该菌纯培养物的周期,提高培养效率。【方法】通过常规培养手段,从患黑痘病黑巴拉多病叶上分离葡萄黑痘病病原菌,PCR扩增该菌ITS片段,经测序后在NCBI比较该片段序列。用同一规格培养皿培养病原菌,每隔7 d观察并统计该病原菌在4种不同培养基组分、5个不同温度梯度、4个不同蔗糖浓度梯度、4种光照时间、5个不同p H条件下共计21 d的生长情况。【结果】分离到病原菌并扩增获得其ITS片段,经比对,该片段序列与NCBI已公布葡萄痂囊腔菌序列AY826763的相似度达99.9%,证实所分离病原菌为葡萄痂囊腔菌(Elsinoe ampelina)。葡萄痂囊腔菌的生长最适培养基为PSA,其次是YEB;最适培养温度为25℃、最适蔗糖浓度为4.5 g/L、最适p H为8,在最适培养温度、蔗糖浓度和p H下病原菌的生长速度分别为0.07、0.03和0.01 cm/d;光照时间对葡萄痂囊腔菌生长影响不明显。【结论】葡萄痂圆孢菌生长受环境条件影响,通过培养条件优化能显著加快其生长速度,提高培养效率。

基于环介导等温扩增技术快速检测茶白星病菌的方法研究

为建立检测茶白星病菌的快速实用分子生物学技术,以痂囊腔菌DNA为模板,根据这种茶白星病菌的基因序列,设计并筛选了4条针对目的基因6个位点的特异性引物,优化的体系条件外引物与内引物比例为1∶3,最佳反应温度与时间分别为63℃与1 h。灵敏度测试LAMP比PCR高10倍,特异性测试痂囊腔菌呈阳性,而炭疽病菌则呈阴性。结果表明,该方法快速、准确、灵敏、特异,具有良好的实用性。