病毒/细胞同步侵染体系筛选抗植物病毒剂的研究

本文采用病毒 /细胞同步侵染体系筛选 3种植物抽提物抗 TMV增殖及对叶绿体的保护作用 ,其中射干抽提物处理转染烟草细胞 96h后对病毒增殖抑制率为 76.0 % ,吴茱萸抽提物抑制病毒对叶绿体的破坏作用达到 89.58% ,筛选出了作用方式不同的抗病毒物质。用植物整株法和大田试验比较病毒 /细胞同步侵染体系测定的结果相近 ,因此病毒

两株棉铃虫胚胎新细胞系的建立及其对杆状病毒侵染的反应

昆虫细胞系的建立在病毒学和昆虫学等领域的研究和应用中发挥着重要的作用。本研究由棉铃虫Helicoverpa armigera胚胎组织建立了两株细胞系,分别命名为QB-Ha-E-1和QB-Ha-E-5,在含10%胎牛血清的TNM-FH培养基中已传代60余代。两株细胞系均以圆形和短梭形细胞为主。DAF鉴定结果表明,两株细胞系均来源于棉铃虫胚胎,其扩增谱带与其他几种昆虫细胞系明显不同;QB-Ha-E-1和QB-Ha-E-5的第30代细胞群体倍增时间分别为63.7h和66.9h。两株细胞系均能被棉铃虫核型多角体病毒(HaSNPV)感染,4d的感染率分别为86.6%和56.5%,对甘蓝夜蛾Mamestra brassicae核型多角体病毒(MbNPV)7d的感染率均为15%左右,但对苜蓿银纹夜蛾Autographacalifornica核型多角体病毒(AcMNPV)侵染的反应不同。DAPI染色和基因组DNA电泳结果表明,AcMNPV可诱导QB-Ha-E-5细胞发生凋亡,极少数细胞内可形成多角体,但不能诱导QB-Ha-E-1细胞发生凋亡,其感染率为55.3%;两株细胞系均可被1.25μg/mL的放线菌素D诱导发生凋亡。两株细胞系具有相同的遗传背景,但对AcMNPV侵染的反应不同,可作为昆虫病毒和细胞之间相互关系以及细胞凋亡机制研究的理想材料。

用超声波法使烟草花叶病毒侵染烟草细胞的研究

本文首次采用超声波法把烟草花叶病毒（ＴＭＶ）粒子导入带壁烟草细胞，建立病毒—细胞高效侵染体系。将烟草细胞置于含ＴＭＶ粒子的缓冲液中，用声强为０．５Ｗ／ｃｍ２的脉冲超声波处理５ｍｉｎ，培养４８ｈ后使用荧光免疫法检测烟草细胞转染率为５９．７％。经酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）检测，ＴＭＶ粒子在烟草细胞体内增殖４８ｈ后达到高峰。电镜观察细胞体内有大量的ＴＭＶ粒子。用枯斑寄主法测定表明ＴＭＶ子代有较高的致病力。

甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒复合侵染甘薯引起的细胞病理学研究

2011～2012年在浙江杭州连续发现感病甘薯植株具有甘薯病毒病SPVD的典型症状,透射电镜观察发现其叶片包含有长度为600～900 nm,直径为12 nm的线状病毒粒子。使用特异性引物进行RT-PCR扩增及测序,其病原为甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)复合侵染。运用透射电镜研究SPVD引起的细胞病理学变化,观察到叶肉细胞的细胞质中含有马铃薯Y病毒属特征性柱状内含体,其结构分类为Ⅳ型;线状病毒样粒子以束状平行排列成聚集体的方式存在于细胞质中;叶绿体伸出伪足状结构包裹线粒体。在维管束细胞的筛管和伴胞中观察到弯曲线状病毒样粒子形成的聚集体,其粒子排列交错,与叶肉细胞中平行排列的病毒样粒子聚集体不同,符合毛形病毒属特征。另外还在维管束和叶肉细胞结合的部位发现复合侵染的细胞病理学特征。本研究表明危害甘薯生产的SPVD已扩散蔓延到浙江省。

小麦黄花叶病毒人工侵染体系的研究

通过大量的接种实验,分析了影响病毒接种效率的各种因素,经ELISA和RT PCR方法进行检测,确立了较为稳定有效的小麦黄花叶病毒机械传毒体系。采用新鲜病叶或用氯化钙干燥保存的病叶作为接种毒源,在0 2mol·L-1磷酸缓冲液中研磨后,对低温下(11～13℃)培养的小麦幼苗(1～2叶龄)进行叶面接种,并将接种后的小麦低温培养可获得较高的接种效率(12 57%～13 43%)。对毒源类型、小麦苗龄和接种部位等其他可能影响接种效率的因素进行了测定。

Rubisco和RCA在青菜叶绿体中的分布及病毒侵染对其细胞定位的影响

运用免疫金标电镜术观察了青菜叶细胞中光合作用关键酶Rubisco和Rubisco活化酶(RCA)的细胞化学定位,结果显示Rubisco和RCA免疫金颗粒主要分布于薄壁组织叶绿体的间质中,在基粒片层上很少,表皮的气孔保卫细胞和维管束薄壁细胞叶绿体内也有分布,在细胞质及线粒体等细胞器中无特异性分布。同时比较观察了感染芜菁花叶病毒(TuMV)的青菜叶绿体Rubisco和RCA免疫金标记结果,发现病组织中结构尚完整的叶绿体Rubisco和RCA标记率略有下降,而结构严重破坏的叶绿体中两种酶标记率分别仅为正常叶绿体的58.44%和64.67%,表明病毒侵染可导致Rubisco和RCA含量下降,影响寄主植物的光合作用。

水稻矮缩病毒云南、浙江分离株侵染水稻植株的细胞病理比较研究

应用超薄切片电镜技术比较观察RDV云南和浙江分离株侵染水稻植株的细胞病理。RDV云南分离株侵染的水稻叶片中,充满病毒粒体的细胞呈条带状分布,呈现出明显的侵染和增殖中心,在充满病毒粒体的细胞周围,相邻细胞有不同程度的病变,叶绿体膜系统消失,部分叶绿体中含有病毒颗粒,线粒体残体及细胞质中有分散或聚集的病毒粒体,细胞核中未见病毒粒体,离侵染中心较远的细胞中亚细胞结构较完整;RDV浙江分离株侵染的水稻叶片中,部分细胞充满病毒粒体,无明显的条带状分布,其他细胞病理特征与RDV云南分离株侵染的水稻叶片相似。RDV不同分离株侵染寄主植株的细胞病理特征无显著差异,对其致病性的差异需进一步研究。

核多角体病毒侵染棉铃虫中肠细胞过程的电镜观察

本文应用电子显微镜技术观察了核多角体病毒入侵棉铃虫中肠细胞及其增殖和释放。经口接种后 3 0min ,有许多病毒粒子进入中肠后部柱状细胞的微绒毛间隙处 ,且以其粒子的一端与微绒毛接触并吸附在微绒毛表面上。接种后 1h,病毒粒子的囊膜与微绒毛的质膜以顶端对顶端、顶端对侧面发生融合 ,仅以核衣壳侵入细胞内 ,然后又继续移至微绒毛底部 ,从而进入中肠细胞内。此外 ,还发现有的病毒粒子直接与柱状细胞的质膜融合 。

同步化法处理软骨细胞后对病毒转染效率影响的研究

目的探讨同步化法对反转录病毒转染软骨细胞效率的影响。方法将构建并经过包装后的反转录病毒载体转染到经低温处理后的同步化兔膝关节软骨细胞,运用免疫荧光显微镜观察荧光显色,并用硝酸还原法检测细胞培养液中一氧化氮(NO)的含量,并与非同步化转染组对照,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞培养液中人白细胞介素-1受体(hIL-1Ra)的表达量,与非同步化的细胞上清液中hIL-1Ra的含量做空白对照。结果酶切鉴定重组基因正确;免疫荧光显微镜观察可见绿色荧光显色;同步化组上清液中NO含量为(145±3)μmol/L,非同步化组上清液中NO含量为(89±3)μmol/L;同步化组上清液中的hIL-1Ra的含量为(65±4)ng/L,明显高于非同步化组上清液中的hIL-1Ra的含量(41±3)ng/L(P<0.05)。结论软骨细胞经同步化后能显著提高反转录病毒载体的转染效率。

水稻矮缩病毒云南、浙江分离株侵染水稻植株的细胞病理比较研究

为探讨水稻矮缩病毒(RDV)不同分离株侵染寄主植物的细胞病理学变化,验证RDV部分基因差异是否引起致病性差异,本文应用超薄切片电镜技术比较观察RDV云南分离株和浙江分离株侵染水稻的细胞病理。结果显示,RDV云南分离株侵染的水稻叶片中充满病毒粒体的细胞呈条带状分布,呈现出明显的侵染中心。在充满病毒粒体的细胞周围,相邻细胞不同程度地病变,叶绿体膜系统消失,部分叶绿体中含有病毒颗粒,线粒体残体及细胞质中有分散或聚集的病毒粒体,细胞核中未见病毒粒体;离侵染中心较远的细胞中亚细胞结构较完整。RDV浙江分离株侵染的水稻叶片中部分细胞充满病毒粒体,无明显的条带状分布,其他细胞病理特征与RDV云南分离株侵染的水稻叶片相似。这些结果表明,RDV不同分离株侵染寄主植株的细胞病理特征无显著差异,对其致病性的差异需进一步研究。

烟草花叶病毒及其核酸侵染烟草愈伤组织悬浮细胞的研究

比较了烟草的茎和叶片来源的愈伤组织对 TMV 侵染和繁殖的影响,发现 TMV 在单倍体植株茎的悬浮细胞中侵染和繁殖最好。TMV 在悬浮细胞中的繁殖曲线表明,接种后25℃保温6小时病毒滴度下降,24小时后对数增加,144—216小时病毒滴度达最高峰,其后病毒滴度下降。接种后经10℃低温预处理10小时、24小时和4天再转到25℃继续保温的细胞中,比接种后直接在25℃保温的大大增加了病毒复制的同步性,以低温处理10小时和24小时最佳。烟草悬浮细胞也适用于 TMV-RNA 接种。

杆状病毒囊膜蛋白介导病毒侵染宿主细胞中的作用

杆状病毒（Baculovirus）是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒,在分类学上属于杆状病毒科（Baculoviridae）,其宿主主要包括鳞翅目（Lepidoptera）、膜翅目（Hymenoptera）和双翅目（Diptera）昆虫.基于杆状病毒全基因组序列构建的系统进化树,将杆状病毒科划分为4个属：Alpha杆状病毒属（以鳞翅目昆虫为特异宿主的NPV）,Beta杆状病毒属（以鳞翅目昆虫为特异宿主的GV）,Gamma杆状病毒属（以膜翅目为特异宿主的NPV）以及Delta杆状病毒属（以双翅目为特异宿主的NPV）[1-2].

猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株侵染Vero细胞特性分析

为了探究PEDV(猪流行性腹泻病毒)流行毒株SHpd/2012侵染细胞的特性,研究采用IFA(间接免疫荧光)及绘制病毒一步生长曲线等方法,对感染PEDVSHpd/2012株后的Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)病变过程进行研究。结果发现,CPE(细胞病变)主要表现为细胞肿胀、变圆、皱缩、聚集成合胞体甚至从培养瓶壁大量脱落。IFA结果显示,接毒后12h病毒开始增殖,在接毒后36h时感染细胞数量最多,其后病毒增殖速度逐步下降,60h时趋于平稳。病毒一步生长曲线结果显示,SHpd/2012株感染细胞后24~60h的毒价一直处于较高水平,60h后开始下降。此外,本研究成功克隆并真核表达了PEDV S蛋白,为研究PEDV与受体蛋白的互作及病毒的致病机制奠定基础。

烟草花叶病毒的侵染部位及细胞病理变化的电镜观察

本文在电镜下观察了烟草花叶病毒（ＴＭＶ）侵染烟叶后，病毒粒体在细胞内的存在部位及病变细胞的超微结构。从粒体的侵染部位分析病毒粒体的入胞及其子代粒体的扩散是以整体形式向胞壁靠拢、附着。随之胞壁凹陷将病毒包夹入细胞内，也有少许病毒粒体是通过胞间连丝进入易感细胞。同时还发现似有病毒直接穿进胞壁入胞的现象。伴随着病毒的侵染，叶片细胞发生诸如片层松散、空泡化、结构肿胀甚至瓦解。此外，还出现了胞核不正常、染色质块呈网络状等超微结构的变化。

茶毛虫核多角体病毒侵染后宿主细胞学的病变

本文应用超薄切片、冰冻断裂、扫描电镜等技术,对茶毛虫核多角体病毒侵染后宿主细胞病理超微结构的变化等进行了研究。结果表明:病毒侵染72—120小时后,宿主中肠细胞器,如线粒体、内质网、核糖体、板层小体、溶酶体等均有明显的病变。同时,在中肠细胞表面有病毒粒子吸附外,细胞表面的微绒毛亦有倒塌肿胀等病症表现。

黄瓜花叶病毒的侵染扩散及病变细胞的电镜观察

在电镜下观察黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的侵染扩散部位发现：病毒粒体入侵细胞及复制后子代粒体的扩散同烟草花叶病毒一样是以整体形式向细胞壁靠拢、附着，并通过胞间连丝进入易感细胞，同时还发现少量病毒粒体似有直接穿过胞壁入胞的现象．寄主植物在病毒入侵后，除了外观上出现病斑，叶片细胞的结构，尤其是叶绿体病变明显，如：外膜不完整、片层松散、结构肿胀，严重时会使整个叶绿体解体．另外，细胞质中还出现许多高尔基小囊泡等超微结构的影响．