转录因子NF-κB对鲤疱疹病毒Ⅱ型基因启动子的表达调控研究

为深入探究NF-κB信号通路对CyHV-2感染过程的影响,在CyHV-2感染的GiCF细胞中加入NF-κB激动剂,通过RT-qPCR和Western Blot分析在感染24、72、96 h后CyHV-2编码基因在转录和翻译水平的表达情况。结果显示,在加入NF-κB激动剂后的72、96 h,CyHV-2编码基因转录和翻译水平均明显高于对照组,提示NF-κB促进CyHV-2编码基因的转录及翻译。为进一步阐明NF-κB如何影响CyHV-2的转录和翻译,利用生物信息学软件预测CyHV-2部分编码基因的启动子序列中和NF-κB的结合位点,采用双荧光素酶报告基因实验分析NF-κB对启动子活性的影响。结果表明,NF-κB过表达提高了病毒基因启动子活性,提示NF-κB可以通过促进CyHV-2基因的启动子活性来增强病毒复制水平。研究结果有助深入探究CyHV-2基因的表达翻译机制,也为开发基于NF-κB信号通路靶点的新的抗病毒抑制剂提供理论支撑。

猪圆环病毒Ⅱ型感染3D4/2细胞的转录组学分析

【目的】通过转录组测序筛选猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus typeⅡ,PCV2)感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2)差异表达基因,为了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和抗PCV2感染药物研发奠定基础。【方法】用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1的PCV2 NJ2002株处理3D4/2细胞,利用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行转录组测序。使用DeSeq 2.0软件进行差异表达基因分析,并对差异表达基因进行基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能分析及转录因子靶向分析,选取免疫及凋亡相关基因进行实时荧光定量PCR验证,用Western blotting技术检测细胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)及磷酸化胞内磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达水平。【结果】转录组测序结果显示,与对照组相比,PCV2感染组共获得713个差异表达基因,其中313个上调,400个下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,差异表达基因与免疫应答等相关,主要富集在细胞外基质受体互作通路、新陈代谢通路、HIF-1信号通路、病毒致癌作用、PI3K-Akt等信号通路。实时荧光定量PCR结果与转录组测序的基因表达水平保持一致。Western blotting检测结果显示,PCV2感染3D4/2细胞24 h后PI3K和Akt蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05)。转录因子靶向分析表明,差异表达基因与核转录因子Y亚基β(NFYB)和ETS转录因子(ELK4)联系紧密。【结论】PCV2可能通过PI3K-Akt信号通路影响下游炎症信号通路和凋亡信号通路增强自身复制能力。NFYB和ELK4转录因子在PCV2感染过程中可能发挥重要作用,可考虑作为抗PCV2药物靶点。研究结果为深入了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和相关药物开发提供了理论基础。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72单克隆抗体的制备及应用

鲤疱疹病毒Ⅱ型是引起鲫造血器官坏死病的重要病原。为建立基于抗原水平的免疫检测方法,通过原核表达方法制备鲤疱疹病毒Ⅱ型核衣壳蛋白ORF72,将纯化的ORF72蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术筛选获得单克隆抗体1B3、4B1、4C2、5F4和5H9。免疫印迹分析显示,上述5株单抗均可特异性识别重组蛋白ORF72;免疫荧光分析显示,仅单抗4C2可与感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的鲫脾脏发生阳性反应。利用单抗4C2通过间接免疫荧光技术对鲤疱疹病毒Ⅱ型感染鎏金金鱼鳍条细胞系(RyuF-2)后ORF72蛋白表达情况进行检测,结果显示,感染后36 h可检测到阳性信号,并且随着感染时间的延长,细胞中ORF72的表达量明显增加。本试验制备的单克隆抗体4C2为体外进一步探究鲤疱疹病毒Ⅱ型在细胞内的复制机制及建立病鱼免疫检测手段奠定了基础。

四川省西昌市中小规模猪场圆环病毒Ⅱ型定殖情况调查与分析

[目的]了解猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)在四川省西昌市中小规模生猪养殖场中的流行情况,为制订综合防控策略提供依据。[方法]查阅中国知网数据库2012年以来有关西昌市PCV2流行病学监测的文献资料,分析PCV2的流行趋势。2023年5-9月,对西昌市部分中小规模生猪养殖场进行了生猪养殖现状调查,采用PCR检测方法对环境拭子进行圆环病毒Ⅱ型检测。[结果]文献资料显示,西昌市2008-2019年PCV2感染情况严重。检测结果显示,西昌市中小规模生猪养殖场圆环病毒Ⅱ型的环境定殖率为17.91%,环境易传播时间在6月和9月,规模较大的养猪场对环境安全的控制措施较好,通过氢氧化钠等进行环境消毒可以做好猪圆环病毒Ⅱ型的防控。[结论]西昌市圆环病毒Ⅱ型在环境中定殖情况较严重,动物疫病预防控制机构和生猪养殖者需有针对性地制定综合防控策略。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66截短蛋白多克隆抗体的制备及互作多肽筛选

为深入探究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在感染过程中的生物学功能,构建了ORF66截短基因的原核表达质粒pET28a-tORF66,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside)16℃诱导蛋白表达,经尿素溶解透析获得溶解的重组蛋白后免疫6周龄小鼠,制备鼠抗tORF66多克隆抗体。将纯化后重组蛋白进行噬菌体展示以此来筛选互作蛋白。经Western Blot检测显示,抗体能够识别感染鲫鳍条细胞系GICF细胞中的鲤疱疹病毒Ⅱ型,效价较高,特异性较好。噬菌体淘选结果通过生物信息学分析显示,得到一条出现频次最高的多肽N′-LHLHQNRMSLSR-C′。该多肽与金鱼基因组中的3个基因有较高的同源性,推断其可能与rORF66重组蛋白相互作用。这将为深入探究ORF66在CyHV-2病毒感染过程中的生物学功能、开发抗CyHV-2病毒新药物及寻找潜在的药物靶点提供新依据。

一例犬冠状病毒Ⅰ型与犬腺病毒Ⅱ型混合感染的实验室诊断

本试验对1例2月龄中华田园犬进行病原诊断,该病犬主要症状为腹泻、血便并伴随流涕、打喷嚏、咳嗽等。采集其鼻拭子、肛门拭子,利用PCR方法分别对7种常见的犬腹泻病毒及呼吸道病毒进行检测,结果显示该病例为犬冠状病毒Ⅰ型与犬腺病毒Ⅱ型的混合感染。待病犬进入濒死期立即安乐死并进行剖检,组织观察可见肺部出现明显的出血斑,盲肠、直肠、结肠有明显的出血点。本试验为犬病毒性腹泻、呼吸道疾病的病毒诊断以及犬冠状病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型自然感染引起的组织病变提供了参考。

猪混合感染圆环病毒Ⅱ型与蓝耳病病毒的诊断及防治

猪感染猪圆环病毒后,免疫系统受损,形成免疫抑制,导致免疫缺陷,在临床上常引发其它病原体混合感染。某猪场发生了圆环病毒Ⅱ型与蓝耳病病毒混合感染的病例,经临床诊断和病毒核酸检测,采取相应的隔离、治疗、保健、消毒等防治措施,取得了良好的防治效果。

常规培养基低血清培养对猪圆环病毒Ⅱ型效价的影响

为了减少抗原生产过程中血清的使用量,节约生产成本、提升产品质量,本试验通过降低常规培养基中血清浓度和不同时间点换液相结合的方法培养猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus typeⅡ,PCVⅡ),收获后对比分析病毒滴度。结果显示试验组的病毒滴度比对照组略高,表明常规培养基降低血清浓度亦能维持细胞生长,并收获与原生产工艺病毒滴度相当的抗原。该方法的应用将减少血清使用量,节约生产成本。

种猪圆环病毒Ⅱ型净化案例探讨

猪圆环病毒病是猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)引起的一种传染病,特别是感染猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type 2,PCV2)后,可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸疾病综合征等,大大增加了养猪成本和防控难度,给养猪业造成重大经济损失。为积极推进动物疫病净化场创建工作,对1家扩繁场引进的种猪进行PCV2的ELISA和PCR检测。通过采用隔离复合用药治疗,最终实现了PCV2净化。本研究的净化技术措施简便易行,对种猪场PCV2净化工作具有一定的示范借鉴意义。

鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用

针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹病毒Ⅱ型,而对大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)以及空白对照无检测信号。取江苏射阳和宝应两地疑似患病鲫组织核酸作为模板进行荧光定量PCR,结果表明反应体系中的病毒量分别为6.89×104copies/μL和3.02×102copies/μL。本研究建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对因鲤疱疹病毒Ⅱ感染引起的养殖鲫造血器官坏死症的诊断与病毒病原定量检测有重要意义。

四川地区腹泻仔猪群猪圆环病毒Ⅱ型分子流行病学调查

为了解四川地区腹泻仔猪群中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的感染情况,本实验采用PCR方法对病料样品进行PCV2检测,并对分离的病毒DNA进行测序及生物信息学分析。结果显示PCV2感染率为71.6%(312/436),阳性结果中肠系膜淋巴结检出率为100%(312/312)。将扩增并测序的19条PCV2序列与Gene Bank中23株参考序列比较分析,构建了系统进化树,结果表明四川省腹泻仔猪群感染PCV2基因型主要为PCV2b、PCV2d基因型。针对PCV2高频突变ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸序列进行生物信息学分析,结果显示主要抗原表位氨基酸位点存在替换,进而引起抗原漂移,这可能促使PCV2免疫原性发生改变。本研究为四川地区PCV2的防制奠定了基础。

鸭疱疹病毒Ⅱ型(暂定名)的分离鉴定

自 1990年以来 ,在福建、浙江和广东等省发生一种以双翅羽毛管淤血呈紫黑色、断裂和脱落以及皮下、脏器 (肝脏、胰脏 )和肠道 (十二指肠、直扬和盲肠 )出血为主要特征的新的鸭传染病 ,暂定名为鸭出血症。我们对从自然感染该病典型病死番鸭脏器中获得的 1株含 2种病毒粒子 (直径大小分别为 30～ 40nm和 80～ 12 0nm)的分离物 ,以Ⅰ型雏鸭病毒性肝炎标准阳性血清进行连续 4代中和后接种番鸭胚 ,收集死亡番鸭胚胚液进行病毒纯化、负染、电镜观察和SPF鸡胚接种试验证明获得单一病毒分离株 (定名为鸭出血症病毒 )。该病毒为不耐酸、不耐碱、不耐热、对氯仿处理敏感、核酸类型为双股DNA的有囊膜病毒 ,直径为 80～ 15 0nm ;对番鸭胚、鹅胚、麻鸭胚、半番鸭胚、北京鸭胚和SPF鸡胚的致死率分别为 10 0 %、10 0 %、78 3 %、6 0 %、82 1%和 0 % ;对 10～ 11日龄番鸭胚的ELD50 为 10 -7.78/ 0 .2ml;无血凝活性 ,不凝集“O”型人、鸭、鸡、鹅、家兔、小鼠 ,豚鼠、猪和绵羊红细胞 ;经血清中和试验证明该病毒与Ⅰ型雏鸭肝炎病毒、雏番鸭细小病毒、雏鹅细小病毒、鸭瘟病毒无血清学相关性。据以上结果可将该病毒确定为疱疹病毒科成员 ,但鉴于其与鸭瘟病毒 (鸭疱疹病毒Ⅰ型 )无血清学相关性 ,则暂定名为鸭疱疹病毒Ⅱ型 ,?

鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生

为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程,利用新建立的对Cy HV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系(Gi CB),对Cy HV-2的理化及生物学特性进行了详细研究,比较了不同来源鱼类细胞系对Cy HV-2感染的敏感性,并对体外培养细胞中Cy HV-2病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察。结果显示,Cy HV-2对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感;常用鱼类细胞系EPC、RTG-2、Koi-Fin、CIK、CCK、PF-Fin对Cy HV-2的感染不敏感,特异性巢式PCR检测盲传至第7代Cy HV-2细胞培养物,结果均为阴性;Cy HV-2在Gi CB细胞中的增殖动态研究结果表明:病毒感染细胞经过12 h的隐晦期,24 h开始进入对数生长期,96 h病毒滴度达到最高值(107.52±0.26 TCID50/m L),然后进入平台期;透射电子显微镜观察结果显示,Cy HV-2感染细胞可分为吸附与侵入、复制与装配、成熟与释放3个主要过程,病毒进入对数生长期后,被感染细胞内可见形态典型的疱疹病毒颗粒。

江苏省及周边地区猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)分子流行病学调查

为了解中国江苏省及周边地区猪圆环病毒Ⅱ型（ PCV2）的分子流行病学以及毒株的遗传变异情况，本研究运用PCR技术对来源于不同地区、不同猪场且PCV2检测为阳性的样品进行全基因组序列的扩增和测序，共获得18株PCV2全基因序列，并对所得到的毒株进行遗传变异分析。结果表明，18株毒株与国内外的参考毒株同源性为93．5％～99？7％，而ORF2核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别为87．1％～99？9％和84．2％～99？6％，说明毒株存在一定程度的变异。系统进化树分析结果显示18株毒株中有5株PCV2a，7株PCV2b，6株PCV2d，其中20150429YC全长为1766 bp，与（HM038031．1 PCV2d等）参考毒株的同源性为100？0％，未发现PCV2c。同时，Cap蛋白的抗原表位和抗原性也发生了变化。说明，目前江苏省及周边地区猪群中PCV2感染较为普遍，PCV2的流行毒株以PCV2b基因型为主，PCV2d次之。

用PCR方法检测猪圆环病毒Ⅱ型

建立了一种能特异性地扩增猪圆环病毒 型 (porcine circovirus type 2 ,PCV- 2 )核酸片段的 PCR方法 ,从疑似断奶猪多系统衰竭综合征 (PMWS)的感染病例的淋巴结和脾脏中扩增出了预期长度的 PCV- 2 DNA片段 ,用限制性内切酶 Eco R 酶切鉴定了 PCR产物的特异性。 PCR产物的核苷酸序列分析表明 ,与已报道的 PCV- 2 (Gen Bank Ac-cession num ber AF0 2 72 17)相关区域的核苷酸序列同源性均大于 96 %。首次证实了我国猪群中存在 PCV- 2感染的PMWS。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法

根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。

猪圆环病毒Ⅱ型ORF3基因缺失突变毒株对仔猪的致病性及免疫原性研究

15头28～30日龄健康仔猪分成A、B、C3组（5头／组），分别肌注接种PCV2ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C、亲本毒株PCV2-CD以及生理盐水。用PCR-RFLP和PCR方法，分别从A组和B组屠宰仔猪的腹股沟淋巴结中特异性检测到mPCV2-C和PCV2-CDDNA，发现mPCV2-C能够在仔猪体内复制增殖。组织病理学结果表明；A组和B组腹股沟淋巴结、肝细胞及肺泡壁上皮细胞呈现病变，其中B组病变较严重，证实ORF3基因缺失未改变PCV2的组织嗜性。外周血T淋巴细胞亚群含量动态检测结果表明：与C组相比，A组、B组外周血CD3^＋、CD4^＋细胞百分含量降低，而A组CD8^＋细胞于免疫后第14天回升，高于B组和C组，表明ORF3基因缺失使病毒对T淋巴细胞亚群的影响有所减弱，并有诱导仔猪细胞免疫应答的趋势。上述结果提示ORF3缺失致使病毒的致病力有降低的趋势。PCV2抗体动态检测发现：mPCV2-C明显诱导了仔猪的体液免疫，具有良好的免疫原性。mPCV2-C可作为PCV2基因缺失疫苗候选毒株。

敲减单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)UL30蛋白表达可抑制HSV-2复制

按照shRNA(small hairpin RNA)设计要求,选择编码单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA多聚酶催化亚单位的UL30(unique long 30,UL30)基因序列保守区域,设计、合成并构建表达UL30序列特异性siRNA(short interfering RNA)的质粒载体pUL30.通过磷酸钙转染法将其转染入HEK(human embryonic kidney)293细胞中,用蛋白印迹法检测对HSV-2 UL30蛋白表达的影响,观察受染细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),终点滴定法测定细胞上清液中病毒感染滴度(50%tissue culture infective dose,TCID50).结果表明,针对UL30基因的siRNA能有效抑制UL30蛋白表达,同时显著抑制受染细胞的CPE,降低上清液中病毒感染滴度.提示本研究建立的针对UL30基因特异性siRNA能有效阻断HSV-2在HEK293细胞内的复制,UL30基因是一个潜在的抗HSV-2复制的药物靶标.

ORF3基因缺失对猪圆环病毒Ⅱ型感染复制能力的影响

设计1对特异性引物AF-P1/AF-P2,从疑似PCV2感染的病料中扩增获得1 767 bp的PCV2全基因组(命名为PCV2-CD),克隆至pMD18-T Simple载体构建重组质粒pTS-PCV2-CD。序列分析表明:PCV2-CD与GenBank中公布的12个PCV2毒株间的同源性高达95.0%~100%。用NcoⅠ酶切pTS-PCV2-CD获得4 459 bp线性目的DNA片段,补平CATG 4个碱基、连接环化构建ORF3基因插入缺失重组质粒pTS-PCV2-CD-C并测序。用SacⅡ酶切pTS-PCV2-CD-C,回收1 771 bp线性目的片段,体外连接环化构建了ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C。PCR-RFLP检测表明,在脂质体转染法转染mPCV2-C、培养并盲传4代的IBRS-2细胞中(PCV1阴性),特异性检测到mPCV2-C的DNA;电镜观察发现,在盲传6代的IBRS-2细胞胞核内观察到突变毒株的病毒颗粒。试验结果表明:ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C具有感染性,能够在IBRS-2细胞中复制增殖,证实ORF3基因不是PCV2复制的必需基因。