病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ的研究进展

病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ（viral macro-phage inflammatory protein-Ⅱ,v MIP-Ⅱ）也称v CCL2,是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染者或移植病人用免疫抑制剂后卡波肉瘤的病原体卡波西肉瘤相关孢疹病毒,即人疱疹病毒-8 K4基因编码的小分子蛋白质,与人CC类趋化因子巨噬细胞炎性蛋白Ⅰ在氨基酸序列上有较高的同源性,是人趋化因子的类似物。

人疱疹病毒8编码的趋化因子vMIP-II在大肠杆菌的优化表达

目的:探讨优化vMIP-II/MBP融合蛋白表达载体pMal在原核细胞中的表达条件,并对其表达产物进行纯化。方法:通过接菌、诱导表达,实验了解诱导时不同的温度、诱导时间、IPTG浓度对蛋白表达量的影响,并进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳分析。结果:发现该菌在含0 3mmol/LIPTG的TB培养基中,28℃诱导表达4h,可使诱导蛋白表达量占菌体蛋白总量的10%。结论:vMIP-Ⅱ/MBP的表达受温度条件影响较大,低温诱导时表达水平较高。从而为该工程菌的中试提供了实验基础。

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测HIV-1前病毒方法的建立及应用

目的建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR技术测定HIV-1前病毒载量方法,并以其观察相关病毒进入抑制剂对HIV-1前病毒的作用。方法选择HIV-1的gag和env保守区域设计引物,建立SYBR Green I荧光定量PCR测定HIV-1前病毒载量的体系,并以其观察6μg/ml^6 ng/ml的重组病毒巨噬细胞炎症蛋白(rvMIP)、逆转录酶抑制剂(AZT)、膜融合抑制剂(T-20)、rvMIP+AZT、rvMIP+T-20对HIV-1前病毒载量的影响。结果所建立的荧光定量PCR体系的检测下限为101Copies,其标准曲线的相关系数为0.998 9,斜率为-4.925,截距为35.70;除6ng/ml的rvMIP、AZT、T-20外,三种药物处理后HIV-1前病毒载量均显著减小(P<0.05),并呈质量浓度依赖性;联合用药者前病毒载量显著低于单用rvMIP者(P<0.05),HIV-1前病毒载量rvMIP+T-20(rvMIP+AZT(rvMIP(T-20(AZT。结论本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有灵敏、快速、准确及成本低廉等优点;与T-20或AZT联用可增强rvMIP对HIV-1前病毒的抑制作用。

黄芪多糖对深Ⅱ度烧伤大鼠免疫功能及创面巨噬细胞炎症蛋白-2和单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

目的研究黄芪多糖(APS)对深Ⅱ度烧伤大鼠免疫功能及创面巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法雄性SD大鼠采用背部约5%体表总面积(TBSA)烫伤建立深Ⅱ度烧伤大鼠模型,并随机分为模型组及实验组,各20只;同时取20只正常大鼠作为对照组。实验组大鼠腹腔注射300 mg·kg^-1·d^-1黄芪多糖0.5 mL,对照组与模型组腹腔注射等量生理盐水,连续干预14 d。干预结束后,测定各组大鼠的创面愈合率;用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)及干扰素-γ(INF-γ)水平;用苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠创面组织形态变化;用蛋白质印迹法检测创面组织MIP-2、MCP-1蛋白表达。结果烧伤后第14天,模型组、实验组大鼠创面愈合率分别为(29.12±6.34)%,(64.73±10.87)%,差异有统计学意义(P<0.05)。烧伤后第14天,对照组、模型组及实验组大鼠创面组织MIP-2蛋白相对表达量分别为0.94±0.06,0.13±0.07,0.56±0.14;MCP-1蛋白相对表达量分别为0.98±0.02,0.06±0.02,0.63±0.12。烧伤后1~14 d,模型组及实验组大鼠血清IL-2、INF-γ水平先升高后降低,模型组及实验组高于对照组,实验组低于模型组(P<0.05),但第14天,对照组与实验组差异无统计学意义(P>0.05);血清IL-4、IL-10水平先升高后逐渐降低,且模型组及实验组高于对照组,实验组高于模型组;烧伤后第14天,与对照组比较,模型组大鼠创面组织MIP-2、MCP-1蛋白相对表达量均降低,实验组显著高于模型组(均P<0.05)。结论黄芪多糖可促进深Ⅱ度烧伤大鼠的创面愈合,调节Th1/Th2细胞平衡,改善免疫功能,其机制可能与上调创面组织MIP-2、MCP-1蛋白表达相关。

病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ在毕赤酵母中的表达及其抗HIV-1活性

目的在毕赤酵母中表达病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ(Viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ),并检测其抗HIV-1活性。方法通过PCR技术从质粒pQE-vMIP-Ⅱ中扩增vMIP-Ⅱ基因,插入酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-vMIP-Ⅱ,转化毕赤酵母菌X33,甲醇诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析和分子筛层析纯化后,进行Western blot鉴定,并检测重组vMIP-Ⅱ蛋白对HIV-1诱导的细胞合胞体形成的抑制作用。结果重组表达质粒pPICZaA-vMIP-Ⅱ经酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组vMIP-Ⅱ蛋白的相对分子质量约为8 500,以分泌形式表达于重组酵母菌的发酵上清中;纯化的重组蛋白纯度达97.3%,且可与HRP标记的vMIP-Ⅱ多克隆抗体发生反应;重组vMIP-Ⅱ蛋白组的合胞体数目明显少于阳性对照组(P﹤0.05),其IC50值为1.35 ng/ml。结论已成功在毕赤酵母中表达了重组vMIP-Ⅱ蛋白,其具有较强的抑制HIV-1的活性。

vMIP-Ⅱ对SIV感染的食蟹猴TCRVβ基因表达的影响

目的检测感染SIV初期用病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ(vMIP-Ⅱ)治疗的食蟹猴外周血T细胞TCRVβ优势表达,分析特异性Vβ亚家族表达水平的变化及T细胞克隆性质的改变。方法11只食蟹猴感染前后外周血PBMC样本共22例通过半定量RT-PCR技术分析其中14个TCRVβ亚家族T细胞的表达情况,运用基因扫描技术分析用药组与感染组差异表达的T细胞TCRVβ7亚家族基因中CDR3的长度了解其克隆性。结果与感染前正常食蟹猴外周血T细胞的14个TCRVβ亚家族中表达(除去表达量极低的10个亚家族)相比较,感染后SIV组中部分样品Vβ7、8、14、16的表达量与感染前比较有上升趋势;vMIP-Ⅱ组中TCRVβ亚家族的表达量上升更加明显。基因扫描结果显示感染前、后标本中Vβ7亚家族的表达由多克隆向寡克隆变化的趋势。结论体内实验研究表明,SIV感染初期的食蟹猴体内部分TCRVβ亚家族有特异性的增生,且克隆性发生改变。vMIP-Ⅱ对此种Vβ亚家族的表达的增生有促进的作用,推测其促使特异性应答的免疫细胞的增生。

病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ对293T细胞APOBEC3G表达的影响

目的探讨病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)表达的影响及其机制。方法转染vMIP-Ⅱ质粒(vMIP-Ⅱ质粒组)、空质粒(空质粒组)至293T细胞。定量PCR和Western 印迹法分析转染vMIP-Ⅱ基因对293T细胞APOBEC3G表达的影响。空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组细胞分别加入1 000 IU/ml干扰素α(IFN-α),培养36 h后,Western印迹法检测空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+ IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+ IFN-α组APOBEC3G的蛋白水平。对转染vMIP-Ⅱ质粒的293T细胞,分别用75 μmol/L JAK/STAT信号通路抑制剂AG490和20 μmol/LERK信号通路抑制剂U0126处理,24 h后收集细胞总蛋白,Western印迹法检测APOBEC3G蛋白水平。构建包含APOBEC3G启动子的荧光素酶报告基因重组质粒,启动子片段包括APOBEC3G全长启动子序列(POS)与长度1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp序列及APOBEC3G启动子序列中不含调控元件的区域(NEG),将荧光素酶报告基因重组质粒和vMIP-Ⅱ质粒共转染293T细胞为实验组,以与空质粒共转染的293T细胞为对照,检测APOBEC3G启动子活性,分析vMIP-Ⅱ调控APOBEC3G转录活性的关键启动子作用区域。统计学比较采用t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。结果 vMIP-Ⅱ转染组APOBEC3G mRNA、蛋白水平(2.500 ± 0.013、1.472 ± 0.013)均高于对照组(1、0.364 ± 0.030,t值分别为 6.22、6.54,均P < 0.05)。空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+ IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+ IFN-α组APOBEC3G水平(分别为1、2.030 ± 0.108、2.700 ± 0.081、2.600 ± 0.099)差异有统计学意义(F = 67.026,P < 0.001),vMIP-Ⅱ质粒组与空质粒+ IFN-α组差异无统计学意义(t = 3.46,P > 0.05)。vMIP-Ⅱ质粒组、vMIP-Ⅱ质粒+ AG490组、vMIP-Ⅱ质粒+ U0126组APOBEC3G水平(0.617 ± 0.025、0.179 ± 0.061、0.359 ± 0.012)差异有统计学意义(F = 70.019,P < 0.001),后两组均低于vMIP-Ⅱ质粒组(t值分别为9.66、11.836,P < 0.01)。荧光素酶活性检测显示,转染了POS、1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp及NEG序列的vMIP-Ⅱ质粒组启动子活性差异有统计学意义(F = 81.092,P < 0.001),从720 bp片段至480 bp片段,APOBEC3G启动子活性降低幅度巨大。结论 vMIP-Ⅱ上调APOBEC3G的表达,可能是通过JAK/STAT信号通路或作用于APOBEC3G转录活性的关键启动子区域。

体外膜肺氧合联合丙种球蛋白治疗儿童重症腺病毒肺炎合并呼吸衰竭疗效观察

目的探讨体外膜肺氧合(ECMO)联合丙种球蛋白治疗儿童重症腺病毒肺炎合并呼吸衰竭的临床疗效及对患儿呼吸功能、炎症反应和免疫指标的影响。方法选择2019年2月至2021年7月郑州大学附属郑州中心医院收治的重症腺病毒肺炎合并呼吸衰竭患儿92例为研究对象。对照组患儿给予甲硝唑、柴桂退热口服液、止咳平喘糖浆,同时给予鼻导管吸气,病情严重者酌情给予呼吸机辅助通气,连续治疗3~5 d。观察组患儿在对照组治疗基础上静脉滴注丙种球蛋白50 mL,每日1次,连续治疗3~5 d;同时应用Bio-Medicus灌注系统、Bio-Console 560离心泵系统、Bio-Pump离心泵给予ECMO,当ECMO循环流量为患儿血流量10%~25%且能维持正常代谢,胸部影像学显示肺部病变吸收良好,肺顺应性改善,血气分析正常,血流动力学稳定时,可考虑停止ECMO。记录并比较2组患儿住院时间、持续发热时间、呼吸机使用时间。治疗后评估2组患儿的临床疗效,并计算总有效率。分别于治疗前后抽取2组患儿清晨空腹外周动脉血2 mL,应用全自动血气分析仪测定氧合指数(OI)、动脉血氧分压(PaO_(2))、动脉血二氧化碳分压(PaCO_(2))。分别于治疗前后应用肺功能测试仪测定2组患者气道阻力。分别于治疗前后抽取2组患儿清晨空腹外周静脉血2 mL,离心,取上清液,使用流式细胞仪测定血清CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)水平,并计算CD4^(+)与CD8^(+)水平比值(CD4^(+)/CD8^(+));采用酶联免疫吸附法测定血清中巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)水平。记录2组患儿治疗期间局部疼痛、胃肠不适、感染等不良反应发生情况。结果观察组患儿住院时间、持续发热时间及呼吸机使用时间均显著短于对照组(P<0.05)。治疗后,对照组和观察组患儿治疗总有效率分别为67.39%(31/46)、89.13%(41/46),观察组患儿治疗总有效率显著高于对照组患儿(χ^(2)=6.389,P<0.05)。2组患儿治疗后的OI、气道阻力、PaCO_(2)均显著低于治疗前,PaO_(2)显著高于治疗前(P<0.05);治疗后,观察组患儿的OI、气道阻力、PaCO_(2)均显著低于对照组,PaO_(2)显著高于对照组(P<0.05)。2组患儿治疗后的CD3^(+)、CD4^(+)水平及CD4^(+)/CD8^(+)均显著高于治疗前(P<0.05);治疗后,观察组患儿的CD3^(+)、CD4^(+)水平及CD4^(+)/CD8^(+)均显著高于对照组(P<0.05)。2组患儿治疗后血清中TNF-α、IFN-γ、MIP-1α水平显著低于治疗前(P<0.05);治疗后,观察组患儿血清中TNF-α、IFN-γ、MIP-1α水平显著低于对照组(P<0.05)。治疗期间,对照组患儿出现胃肠不适2例,感染2例,不良反应发生率为8.70%(4/46);观察组患儿出现局部疼痛2例,不良反应发生率为4.35%(2/46)。2组患儿的不良反应发生率比较差异无统计学意义(χ^(2)=0.178,P>0.05)。结论在常规治疗基础上应用ECMO联合丙种球蛋白治疗儿童重症腺病毒肺炎合并呼吸衰竭的临床疗效显著,有助于改善呼吸相关指标,减轻炎症反应,增强机体免疫力,且安全性较高。

巨噬细胞炎症蛋白-1α对小鼠肝癌的基因治疗

目的 观察重组腺病毒载体介导的小鼠巨噬细胞炎症蛋白 1α(MIP 1α)对小鼠肝癌的基因治疗效果。方法 携带小鼠MIP 1α基因的腺病毒载体 (AdmMIP 1α)体外感染小鼠肝癌细胞株Hepa1 6 。 48h后 ,用载体自身报告基因表达的绿色荧光蛋白检测感染效率 ;RT PCR法检测感染后细胞内MIP 1α的表达 ;每天计数细胞 ,观察细胞的体外生长曲线。皮下接种Hepa1 6细胞建立小鼠肝癌模型 ,肿瘤局部分别单次注射 1× 10 9cfu的AdmMIP 1α、空载体对照 (Ad empty)和PBS ,观察肿瘤大小和小鼠生存期。结果 腺病毒载体AdmMIP 1α体外能有效地感染靶细胞Hepa1 6 ,并在感染后的细胞内检测到mMIP 1α的mRNA ,体外感染对Hepa1 6的生长曲线无显著影响。瘤体内单次注射AdmMIP 1α导致 4/ 9只小鼠肿瘤完全消退 ,并延长小鼠生存期 ,与对照组比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 0 1)。结论 腺病毒介导的MIP 1α基因治疗对小鼠肝癌有一定的效果 。

诺如病毒腹泻患者血清I-FABP、MIP-1α水平检测及诊断价值分析

目的探讨诺如病毒感染性腹泻患者血清肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)水平检测及诊断价值。方法纳入本院收治的诺如病毒感染性腹泻患者90例(诺如组),细菌感染性腹泻患者90例(细菌组)及健康志愿者90例(对照组)。酶联免疫吸附法检测血清I-FABP、MIP-1α水平,比较3组血清I-FABP、MIP-1α水平差异。诺如组根据脱水分型将其分为:无脱水(28例)、轻度脱水(37例)与严重脱水(25例),分析不同脱水分型患者血清I-FABP、MIP-1α及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)、白介素(IL)-6水平。受试者工作特征(ROC)曲线评价血清I-FABP、MIP-1α对细菌感染性腹泻与诺如病毒感染性腹泻的鉴别价值,Pearson法分析血清I-FABP、MIP-1α水平与炎症因子水平相关性,多元线性回归分析诺如组血清I-FABP或MIP-1α水平的影响因素。结果对照组、诺如组及细菌组患者血清I-FABP[(2.57±0.43)ng/mL、(4.29±0.61)ng/mL、(5.22±0.70)ng/mL]、MIP-1α水平[(109.64±17.88)pg/mL、(173.52±19.05)pg/mL、(201.74±18.46)pg/mL]逐次升高(P<0.05)。ROC曲线显示,血清I-FABP、MIP-1α单独鉴别诺如病毒感染性腹泻与细菌性腹泻的截断值分别为4.97 ng/mL、191.59 pg/mL,AUC分别为0.836、0.884,准确度分别为78.33%、80.00%,而二者联合检测的AUC为0.950,准确度为87.22%,联合检测的AUC优于单独I-FABP、MIP-1α(Z/P=4.453/0.000、3.437/0.001)。与对照组相比,诺如组血清TNF-α、IL-6、CRP水平升高,与细菌组相比,诺如组血清TNF-α、IL-6、CRP水平降低(P<0.05)。无脱水患者血清I-FABP、MIP-1α、TNF-α、IL-6、CRP低于轻度脱水,轻度脱水患者血清I-FABP、MIP-1α及TNF-α、IL-6、CRP水平低于严重脱水(P<0.05)。相关性分析显示,诺如病毒感染性腹泻患者血清I-FABP、MIP-1α水平均与TNF-α、IL-6、CRP呈正相关(P<0.01)。多元线性回归分析,发现血清TNF-α升高、IL-6升高、CRP升高均是I-FABP、MIP-1α的影响因素(P<0.05)。结论诺如病毒感染性腹泻患者血清I-FABP、MIP-1α水平低于细菌性腹泻者,可用于鉴别诺如病毒感染性腹泻与细菌性腹泻,且二者均与炎症因子呈正相关,可能通过调控炎症反应参与诺如病毒感染性腹泻发病过程。

小鼠MIP-1α真核表达质粒的构建及在HSV-II核酸疫苗中的应用

目的构建小鼠巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)的真核表达质粒,观察其作为分子佐剂对单纯疱疹病毒II型(HSV-II)DNA疫苗免疫效果的影响。方法以LPS刺激RAW264.7细胞提取总RNA。采用RT-PCR扩增出MIP-1α基因的全部编码序列,利用克隆载体pUCm-T,将其亚克隆入pcDNA3中,构建出小鼠MIP-1α的真核表达质粒Pm;将其转染COS-7细胞,并用Boyden趋化小室法检测MIP-1α的生物学活性。然后用其与HSV-IIgD的DNA疫苗一起免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠的特异性抗体、脾T细胞增殖反应及病毒攻击小鼠后对小鼠的保护率,观察MIP-1α对HSV-IIDNA疫苗免疫效果的影响。结果成功构建了小鼠MIP-1α的重组真核表达质粒;免疫BALB/c小鼠发现,其作为分子佐剂可加强HSV-IIgDDNA疫苗的免疫效果。结论小鼠MIP-1α可作为HSV-IIgDDNA疫苗的分子佐剂,为研制新型有效的HSV-IIDNA疫苗提供一定的依据。