假病毒中和试验对狂犬病毒中和抗体效价的检测效能分析

目的:组织不同的实验室分析假病毒中和法(Pseudo Virus-based Neutralization Assay,PBNA)对不同样品的狂犬病病毒中和抗体水平的检测能力,并比较其与经典的快速免疫荧光灶抑制试验(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test,RFFIT)以及小鼠中和试验法(Mouse Neutralization Test,MNT)的相关性。方法:共9家实验室,分别采用PBNA、RFFIT以及MNT法对6份样品进行狂犬病病毒中和抗体检测,每个实验室进行3~5次重复实验。采用配对t检验及Pearson相关系数对3种检测方法的结果进行统计学分析。结果:PBNA与RFFIT、PBNA与MNT、RFFIT与MNT Pearson相关系数分别为0.985、0.988和0.974,抗体几何平均滴度进行t检验,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:3种方法重复检测6份样品的定量结果具有高度的相关性,PBNA法可作为《中华人民共和国药典》方法RFFIT、MNT的一种替代或补充方法,用于人用狂犬病疫苗临床血清、狂犬病人免疫球蛋白及抗狂犬病血清的狂犬病病毒中和抗体效价检测。

单细胞测序技术筛选出高效的新型冠状肺炎病毒中和抗体

新型冠状肺炎(COVID-19)是一种传染性极强的急性呼吸道疾病,病毒基因组及系统进化分析揭示该病的病原体为第7个可感染人的冠状病毒——新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)。近一年来人们在探索治疗COVID-19患者的过程中发现早期康复患者的血浆中含有可以有效抑制SARS-CoV-2的抗体。这为人们治疗COVID-19患者提供了新的思路。

国家药监局应急批准腾盛华创新冠病毒中和抗体联合治疗药物注册申请

近日,国家药品监督管理局应急批准腾盛华创医药技术(北京)有限公司新冠病毒中和抗体联合治疗药物安巴韦单抗注射液(BRⅡ-196)及罗米司韦单抗注射液(BRⅡ-198)注册申请。这是我国首家获批的自主知识产权新冠病毒中和抗体联合治疗药物。此次获批是基于美国国立卫生研究院(NIH)支持的ACTIV-2的Ⅲ期临床试验,包括847例入组患者最终结果显示,与安慰剂相比,安巴韦单抗/罗米司韦单抗联合疗法使临床进展高风险的新冠门诊患者住院和死亡风险降低80%(中期结果为78%)。

新型冠状病毒中和抗体类药物的研究进展与药学评价

新型冠状病毒的反复感染仍威胁着全球公众健康。研究人员依然致力于从疫苗、小分子抗病毒药物和中和抗体等多方面开展研究,为新型冠状病毒各类变异株的感染寻找更为有效的预防、治疗手段。其中,中和抗体具有作用机制明确、安全性高、便于大规模生产等优势,是极具潜力的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)治疗药物之一,国内外针对新型冠状病毒中和抗体的研发项目发展迅速,本文简要介绍新型冠状病毒中和抗体研究现状,重点结合审评实践,提出对于此类品种药学评价的特殊考虑,以期促进国内同类产品尽快实现产业化。

三种ELISA方法与荧光抗体病毒中和试验检测狂犬病抗体的一致性分析

为筛选合适狂犬病抗体检测的试剂盒,该研究以荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibody virus neutralization FAVN)方法为参照,与3个ELISA试剂盒方法进行比对,进行一致性分析,并计算了三种试剂盒的敏感性和特异性。结果显示:三种不同的试剂盒中,试剂盒A与FAVN一致性最好,Kappa值为0.605,有较高的一致性,符合率为86%;试剂盒B次之,Kappa值为0.485,为中度一致,符合率为80%;试剂盒C与FAVN的一致性最差,Kappa值为0.310,符合率也最低,为74%。在敏感性和特异性方面,试剂盒A的敏感性最高,为92.1%,试剂盒B的特异性最高,为72.7%。本研究为临床上科学的筛选试剂盒提供了依据。

基于微量病毒中和抗体试验的新冠肺炎临床确诊病例血清样本的抗体检测方法评价

目的使用新冠肺炎确诊病例血液样本对荧光免疫层析法、胶体金法和微量病毒中和抗体试验等血清学方法进行评价,比较3种试验方法检测结果的差异,为临床治疗和流行病学调查提供技术手段。方法采用新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)IgG/IgM抗体联检试剂(荧光免疫层析法)和2019-nCoV抗体检测试剂盒(胶体金法)及由广东省疾病预防控制中心实验室分离的2019-nCoV病毒株建立的微量病毒中和抗体试验对临床确诊患者血液样本进行检测。结果本研究收集广东省第二人民医院2019-nCoV临床确诊患者血液样本113份,患者年龄中位数为47.50(32.00,57.00)岁,性别比2.77∶1;患者微量病毒中和抗体试验最高滴度1∶1024;以微量病毒中和抗体试验结果作为金标准时,胶体金法检测灵敏度高于免疫层析法(94.74%vs 82.46%),两者Kappa值分别为85.84%和75.24%,阴性和阳性预测值分别为94.44%、91.53%和83.87%、92.16%。结论在检测2019-nCoV的血清学方法中,以微量病毒中和抗体试验为金标准时,相比荧光免疫层析法,胶体金法灵敏度和Kappa值更高,更适宜于2019-nCoV病例的快速检测。

新冠病毒抗体ELISA筛查假阳性反应:不同方法检测结果的内在逻辑

目的在无偿献血人群中,分析新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbnent assay,ELISA)抗体筛查出的反应性标本采用不同检测方法的检测结果。方法对2020年3—4月,深圳地区8632人次献血者血浆中ELISA筛查出SARS-CoV-2总抗体(total antibody,TAb,包括IgG、IgM、IgA)阳性标本(PC组)及其追踪血浆标本(FC组),2020年1—4月疾病对照标本(DC组)采用以下方法检测:(1)ELISA方法检测IgG,IgM和(或不用检测)TAb;(2)假病毒中和抗体试验(pVNT);(3)SARS-CoV-2抗体免疫印迹试验(Western Blot,WB)。2020年2—4月阴性对照标本(NC组),采用ELISA和WB方法检测。结果34例总抗体阳性标本中,2例pVNT试验阳性、初次筛查标本和追踪标本总抗体和IgG均阳性,WB结果阳性,判定为确证阳性;其余2例pVNT试验阳性,WB结果阳性的标本在追踪随访阶段,总抗体、IgG及pVNT结果不符合抗体演变规律,尚不能判定为确证阳性。结论新型冠状病毒ELISA筛查抗体反应性标本感染状态可综合pVNT、WB和追踪标本抗体动态变化的逻辑进行判断。

狂犬病疫苗接种者抗狂犬病病毒中和抗体影响因素分析

目的探讨狂犬病疫苗接种后体内抗狂犬病病毒中和抗体产生的影响因素。方法采集2018年1-8月山东、江苏、河南、河北、湖南和安徽6省疑似狂犬病Ⅱ/Ⅲ级暴露后接种狂犬病疫苗的暴露者血清标本,快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测抗狂犬病病毒中和抗体(RVNA)水平,采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析。结果全程接种狂犬病疫苗的血清样本为498份,RFFIT检测结果显示,RVNA几何平均滴度(GMT)为4.94 IU/ml,血清阳性率为96.18%(479/498)。不同组别抗体阳性率分析结果显示,免疫时间各组阳性率之间差异有统计学意义(χ^2=7.888,P=0.039),30~90 d组抗体阳性率高于91~180 d组,其他各组比较差异均无统计学意义。多因素分析结果显示年龄、免疫时间是RVNA水平的重要影响因素,其中年龄与RVNA水平呈正相关,免疫时间与RVNA水平呈负相关。免疫时间对RVNA水平的影响最大,影响重要性为0.62。结论接种狂犬病疫苗后能产生可靠的免疫效果,年龄、免疫时间等因素对抗体阳性率及RVNA水平有一定影响。暴露后在及时进行规范完整的暴露后处置外,应对经常暴露于狂犬病的高危人群、免疫力低下者或患有免疫抑制性疾病的人群定期检测血清抗体,对于RVNA滴度小于0.5 IU/ml的接种者应及时进行加强免疫,补接种疫苗,从而有效预防狂犬病。

表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究

为确定狂犬病病毒(RV)Flury-LEP株外源基因的插入位点及其中和抗体快速检测方法,本研究在建立了RVFlury-LEP株反向遗传操作系统的基础上,构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组LEP基因组cDNA克隆pCI-LEP-EGFP,并成功拯救出重组病毒(rLEP-EGFP)。rLEP-EGFP的生物学特性和野生型LEP(wtLEP)在NA细胞和BHK-21细胞中的生长动力学及对小鼠的致病性没有显著差异。rLEP-EGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,各代次重组病毒均稳定表达EGFP。重组表达的EGFP可用于中和抗体检测,rLEP-EGFP免疫犬血清经间接免疫荧光(IFA)或荧光下直接观察检测RV中和抗体滴度,两种检测结果显示较好的相似性(p>0.05)。本研究为研制以Flury-LEP株活载体多价疫苗奠定了基础,并为病毒中和抗体的检测提供了更为快捷的新方法。

抗狂犬病病毒中和抗体检测技术研究进展

抗狂犬病病毒中和抗体(rabies virus neutralizing antibodies,RVNA)是唯一能中和狂犬病病毒的保护性抗体,其水平的高低是评价狂犬病疫苗免疫保护效果的一项重要指标,在狂犬病病例诊断等方面也有重要意义。国内外专家先后建立了多种检测RVNA的方法,如小鼠中和试验、快速荧光灶抑制试验、荧光抗体病毒中和试验等,本文将简要对目前常用的RVNA检测方法进行介绍,并对其原理和优缺点进行综合评价。

抗狂犬病病毒中和抗体快速荧光灶抑制试验方法的验证

目的对抗狂犬病病毒中和抗体(Rabies virus neutralizing antibody,RVNA)快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)进行验证。方法利用已检测RVNA效价的人狂犬病疫苗免疫后血清建立血清参考品。采用参考血清和狂犬病人免疫球蛋白标准品,评价RFFIT方法的准确性、重复性、稳定性、线性和检测范围。结果共制备5批血清参考品(A、B、C、D和E),RVNA效价分别为57.39、16.54、8.76、1.38和0.08IU/mL。采用效价适中的参考血清C进行RFFIT方法的认证。参考血清样品C加标(4.5IU/mL、2.25U/mL和1.125IU/mL)后的回收率分别为91.70%、80.15%和74.96%。同一实验人员对相同样品检测6次的RVNA中和效价的变异系数(Coefficient of variation,CV)为7.61%;2名实验人员对相同样品各检测3次的RVNA中和效价的CV为3.88%。标准品效价值与RFFIT方法检测值的线性方程为y=0.9524x-0.1192(R^(2)=0.999),最低检出效价为0.04IU/mL。不同病毒-抗体中和时间、细胞-抗体-病毒孵育时间、丙酮固定时间和荧光抗体染色时间测定的参考血清C中和效价的CV均<30%。结论本研究建立的RFFIT方法对人狂犬病疫苗免疫后血清检测具有很好的准确性、重复性、线性和稳定性,推荐在相关血清检测中应用。

快速荧光灶抑制试验检测狂犬病病毒中和抗体效能评价

目的对人血清中狂犬病病毒中和抗体快速荧光灶抑制试验(RFFIT)进行方法效能评价,为其推广提供技术支撑。方法采用国际标准品、质控参考品和临床血清样品,评价RFFIT方法的检出限、线性、重复性、重现性、特异性和抗干扰能力,并建立质量控制体系。结果 RFFIT方法检出限为0.15 IU/ml;线性曲线斜率为0.999 11,r^(2)=0.980 98;批内重复性和批间重复性的变异系数<5%和<15%;2名不同人员检测结果差异无统计学意义(t=0.348,P=0.731),定性一致率高达100%;71份阳性样品和5份阴性样品定性检测结果的符合率均为100%;8份乳糜血去除乳糜前后的检测结果差异无统计学意义(t=0.022,P=0.983);室间质控和室内质控的变异系数均不超过30%。结论本室建立的RFFIT方法检测效能良好,适用于推广应用。

新型狂犬病病毒中和抗体检测方法的建立

目的建立一种安全、快速、经济的新型狂犬病病毒中和抗体的检测方法。方法在狂犬病病毒弱毒株HEP-Flury基因组Ψ区插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein eGFP)基因,利用反向遗传技术,拯救重组病毒rHEP-eGFP,分别采用荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定及电镜观察等方法对rHEP-eGFP病毒进行鉴定;分别绘制rHEP-eGFP和亲本毒株HEP-Flury的生长动力学曲线;将rHEP-eGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,测定各代次rHEP-eGFP的滴度,荧光显微镜下观察eGFP的表达;采用TCID50法检测狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11和rHEP-eGFP的毒力;以rHEP-eGFP病毒为抗原,建立新型荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibodyvirus neutralization,FAVN)-eGFP,对25份犬血清的抗体效价进行测定,并与标准FAVN检测结果进行比较。结果经荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定和电镜观察表明,成功拯救出rHEP-eGFP病毒;重组病毒rHEP-eGFP与亲本病毒HEP-Flury的生长特性相似;rHEP-eGFP连续传代9次,均能稳定表达eGFP;CVS-11的毒力为108TCID50/ml,rHEP-eGFP的毒力为107.3TCID50/ml;FAVN-eGFP与FAVN测定25份犬血清抗体效价的结果具有良好的一致性。结论建立的新型狂犬病病毒中和抗体检测方法(FAVN-eGFP)准确度高,特异性好。

探索病毒中和抗体 肩负疫病防治使命--记深圳市第三人民医院特聘研究员鞠斌

人类的历史,就是与病毒抗争的历史。地球上的病毒多得数不清。迄今为止,已经被科学家鉴定的病毒有5000多种,其中有差不多100种会让人类致病。病毒狡猾,但人类也在进步。在付出无数生命代价的同时,人类的医学科技和防疫水平也在不断提升。长年来和病毒打交道,鞠斌深知:人与病毒的抗争是永恒的课题。人与病毒之间的平衡博弈,更需要依靠科学来理解与认识。

单克隆抗体竞争ELISA和FAVN检测狂犬病病毒免疫抗体的对比

为对比狂犬病荧光抗体病毒中和试验(FAVN)和单克隆抗体竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法的相关性,用2种血清抗体检测方法分别检测在深圳市收集的798份宠物犬血清样品,利用McNemar检验和Kappa一致性检验对比研究2种方法的检测结果。结果显示:以FAVN方法检测结果为标准,单克隆抗体竞争ELISA方法的符合率为96.7%(95%CI:95.3%~97.8%),敏感性为97.6%(95%CI:96.2%~98.5%),特异性为84.9%(95%CI:72.9%~92.7%),约登指数为0.825。经McNemar检验,2种血清抗体检测方法的检测结果差异不具有统计学意义(P=0.078>0.05);经Kappa一致性检验,2种血清抗体检测方法检测结果不一致是小概率事件(P<0.001),且两者的检测结果一致性高(Kappa系数=0.758)。结果表明,用单克隆抗体竞争ELISA方法代替FAVN用于犬狂犬病病毒免疫抗体的大规模监测具有一定的可行性。

我国部分城乡犬狂犬病中和抗体水平调查

以国际兽疫局(OIE)推荐的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)对随机采自广东、河北、北京等地区的573份犬血清进行了狂犬病病毒中和抗体效价的测定,以确定犬群中狂犬病的免疫状况。结果显示,在不同地区或不同城市的动物防疫区域中,犬体内狂犬病病毒中和抗体平均水平存在着明显的差异,城市犬的中和抗体水平较高,有的中和抗体保护水平(0.5IU/mL)阳性率高达100%,少数则达不到保护水平,不同防疫区域狂犬病中和抗体水平为(0.08±0.03)^(4.39±1.45)IU/mL,平均保护水平阳性率为46.3%;乡村看家犬病毒中和抗体水平普遍较低,大部分犬体内无中和抗体,只有个别犬体内存在水平较低的中和抗体,平均保护水平阳性率为1.8%。

FAVN与RFFIT在动物和人狂犬病中和抗体检测中的比较

目的比较荧光抗体病毒中和试验(FAVN)和快速荧光灶抑制试验(RFFIT)两项技术用于动物和人血清狂犬病中和抗体检测的差异。方法以FAVN和RFFIT两种方法分别对60份动物及人血清进行狂犬病中和抗体的平行定量检测,应用配对定量资料的t检验对所得数据进行统计学分析。结果以0.5IU/mL的国际推荐标准,对同一样品经FAVN和RFFIT两种方法测定的中和抗体效价进行定性判定,二者对全部60份样品的检测符合率为96.67%(58/60)。统计学分析显示,两种检测方法对总体样品及不同动物样品的定量检测结果差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 FAVN和RFFIT可通用于动物和人血清的狂犬病中和抗体检测。

狂犬病疫苗免疫后中和抗体持续时间

世界卫生组织建议狂犬病疫苗的最低抗原含量应≥2.5IU疗刊,接种第1剂疫苗14d后可提供足够的狂犬病病毒中和抗体滴度(≥0.5IU/mL)。临床医生经常被问及暴露前或暴露后免疫狂犬病疫苗诱导的免疫持续多长时间。这篇论文基于先前的研究表明,世界卫生组织认可的现代组织培养狂犬病疫苗能够带来持久的免疫记忆,疫苗诱导的免疫保护通常会维持3~5年,但部分人狂犬病病毒中和抗体可维持10年以上。健康人在初次接种狂犬病疫苗多年后进行加强免疫,会快速产生中和抗体反应,并且不需要使用免疫球蛋白。

狂犬病毒ELISA抗体检测试剂盒的初步应用

以灭活纯化的狂犬病毒SRV9株作为包被抗原，制备了5批次狂犬病毒ELISA抗体检测试剂盒中试产品。与FAVN法、商品化进口试剂盒相比，该试剂盒与二者总符合率为90.80%和94.25%，且敏感性较高。5批次试剂盒批内变异系数为1.47%~8.34%，批间变异系数为2.05%~8.64%，说明该试剂盒重复性良好，可用于血清中狂犬病毒抗体常规检测。

抗SARS-CoV-2相关线性表位抗体诱发小鼠神经炎性反应

目的评价已知的SARS-CoV-2刺突蛋白线性抗原表位相关非病毒中和抗体的潜在生物学功能。方法根据报道优选出COVID-19患者中响应频率最高、抗体存留时间最长的线性抗原表位S2-78为研究对象。用血蓝蛋白偶联的S2-78多肽(KLH-S2-78)免疫小鼠后,对其血清中的anti-S2-78 IgG抗体水平、小鼠行为学表型和大脑中小胶质细胞数量密度进行检测。结果KLH-S2-78免疫小鼠外周血中出现高滴度的anti-S2-78 IgG抗体(最高滴度为25600,A_(450)=0.3055),呈现为感觉运动门控缺陷、嗅觉功能受损和自发活动能力受损的精神病样行为学表型,大脑前额叶皮质和海马体中小胶质细胞数量密度显著增加(P<0.05),处于中枢炎性反应应激状态。结论Anti-S2-78 IgG抗体有可能通过激发机体的炎性反应导致大脑神经炎性损伤。