茄科作物基因组内源病毒元件的分析鉴定

利用6个茄科物种的35个公开基因组数据进行了茄科基因组内源性病毒元件(endogenous viralelement,EVE)的挖掘。结果发现,主要来源于花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)等共17种疑似的植物EVE。其中,烟草脉明病毒(tobacco vein clearing virus,TVCV)序列以大片段的形式普遍存于几乎所有收集的茄科植物基因组中,含量大约在0.01%~0.32%,片段平均长度范围为500~2300 bp,序列数量范围为200~5000条。以马铃薯DM1-3基因组为例分析这些TVCV内源序列的分布和组成,发现内源性TVCV序列在马铃薯DM 1-3的12条染色体上分散排布,平均每条染色体上有57条序列;这些内源病毒序列与TVCV基因组比对,虽然它们无法覆盖TVCV完整基因组序列,但是能够覆盖完整的编码区。进一步通过RT-PCR和原位杂交定位,验证了TVCV在马铃薯材料中的存在和分布。

传毒媒介基因组中内源性病毒元件多样性及功能的研究进展

在病毒与宿主的长期相互作用中,部分病毒基因序列可以被整合到宿主基因组中,形成内源性病毒元件(endogenous viral element,EVE)。随着近年来基因组学和宏病毒组学的发展,研究人员发现除逆转录病毒外,非逆转录RNA病毒同样可以被整合到传毒媒介等真核生物基因组中,形成内源性非逆转录RNA病毒元件(non-retroviral EVE,nrEVE),但关于其具体功能的研究较少。鉴于传毒媒介传播的动物病毒和植物病毒对人、动物及植物造成严重危害,该文聚焦近年来国内外关于传毒媒介基因组中的EVE,特别是nrEVE的研究,总结了EVE的定义及发现,蚊子、蚜虫、蓟马、飞虱和蜱虫等重要传毒媒介中EVE的多样性及功能,并对该领域的后续研究重点进行展望,以期为揭示RNA病毒与宿主的长期协同进化关系及发展新的抗虫策略提供理论基础。

介导植物病毒病症状发生的病毒元件与寄主因子

植物遭受病毒侵染后,常表现出花叶、发育畸形、褪绿、坏死等症状。在农业生产中,这些症状的发生直接导致作物的产量/品质下降,有些造成严重的经济损失。因而,病毒病症状发生的分子机制长期以来一直为人们所关注。结合近年来国内外最新的研究报道,分别从病毒和寄主两个方面,总结归纳了介导症状发生的病毒元件以及参与症状发生的寄主因子,并在此基础上分析讨论了病毒病症状发生的分子机制。

乙型肝炎病毒转录后调节元件的研究进展

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)转录后调节元件(HBV posttranscriptional regulatory element,HPRE)是位于HBV基因组内的一段调控序列。因其在转录后水平调节HBV的基因表达而命名。它对HBV基因的高表达是非常重要的。自从1993年被发现后,它的功能机制及与其相互作用的蛋白因子一直是人们的研究热点,为深入研究HBV基因表达的调控机制创造了条件。同时,这些研究可能促进下调病毒基因表达的新的机制的形成,为防治HBV感染的相关疾病奠定了基础。

含有不同启动子、WPRE以及ITRs对重组杆状病毒表达新城疫F蛋白的影响

为了提高基因工程疫苗对新城疫病毒F蛋白的表达能力,从而为研制高效基因工程疫苗奠定了基础。利用Western blot技术检测含有不同启动子与表达元件的重组杆状病毒,在中国仓鼠卵巢细胞中其F蛋白的表达量的差异。Western blot结果显示,含有CMV立即早期增强子区与鸡肌动蛋白启动子区的复合启动子的质粒表达F蛋白量较含人巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)的质粒提高了24.52%~231.18%,含有土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)能够提高F蛋白表达量2.9~8.6倍,而腺伴随病毒末端反向重复序列(ITRs)对质粒F蛋白表达量提高1.95%~9.27%。CBA启动子的启动能力远高于CMV的启动能力,调控元件WPRE能够显著提高F蛋白的表达量,而ITRs元件对于F蛋白的表达量未产生显著提高。

Expression Activity of CLCuV Bidirectional Promoter in Agrobacterium tumefaciens

Cotton leaf curl virus (CLCuV) belongs to the subgroup III of geminiviruses with single strand DNA genome. Study demonstrated that the bidirectional promoter of CLCuV had activity in Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend) Conn. This is the first report for the activity of the bidirectional promoter of geminivirus in A. tumefaciens. Results showed that the activity of the complementary sense promoter was stronger than that of virion sense promoter, and was detected 2-fold higher than that of CaMV 35S promoter in A. tumefaciens. Moreover, the promoter 5' deletion analysis indicated that the mean GUS activity driven by a 287 nucleotides complementary sense promoter fragment (from-287 to the translation initiation site) is 4 times higher than that driven by the whole complementary sense promoter in A. tumefaciens. This result suggested that there might exist negative regulatory elements in this deleted fragment. The function of other cis-elements included in CLCuV complementary sense promoter was also discussed in this paper.

Construction of retroviral vector carrying HSV tk gene under control of human AFP enhancer core sequence and human pgk promotor *

AIM Tenstruct retroviral vector bringing HSV tk gene under control by human AFP enhancer core sequence and human pgk promotor.

淋巴瘤特异性高效基因表达载体survivin-VISA的构建与鉴定

目的构建含survivin启动子及VP16-GAL4-WPRE整合型系统性放大系统(VISA)的淋巴瘤特异性高效基因表达载体survivin-VISA(S-VISA)。方法应用基因重组技术构建含survivin启动子与土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、二步转录放大系统(TSTA)和VISA系统分别构成的表达载体S-WPRE、S-TSTA和S-VISA,经PCR法及酶切鉴定。用脂质体法转染淋巴瘤细胞株Ramos、U937、Raji及人肝细胞株Chang Liver,检测荧光素酶活性。结果表达载体S-WPRE、S-TSTA和S-VISA通过PCR法及酶切鉴定证明构建正确,荧光素酶活性检测表明S-VISA载体在淋巴瘤细胞中实现了目的基因特异性高效表达。结论成功构建了含survivin启动子及VISA系统的淋巴瘤特异性高效基因表达载体S-VISA,为淋巴瘤基因治疗的进一步研究奠定了良好的基础。

EF1α启动的高效重组杆状病毒载体的构建及其表达效果

【目的】通过选用哺乳动物细胞特异性启动子—人类延伸因子1α启动子(Elonggation factor 1αpromoter,EF1-α)、利用病毒假型化工具—截断型水疱型口膜炎病毒G蛋白(Truncated Vessicular stomatitis virus protein G,VSV-GED)、添加转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)和腺病毒反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITRs),来提高杆状病毒的转导效率及外源基因的表达水平。【方法】从pFB-VSV-GED-WPRE出发构建含EF1α启动子的2个重组杆状病毒转移载体pWK和pWK-ITR。再以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)基因为报告基因插入EF1α启动子的下游,构建重组转移载体pWK-eGFP和pWK-ITR-eGFP以及阴性对照pWK(-)-eGFP。将构建好的重组质粒转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,侵染少突神经胶质细胞(OL细胞)后,利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】含有WPRE和ITRs的病毒BV-WK-eGFP、BVWK-ITR-eGFP荧光表达率明显高于阴性对照,且ITRs能够有效延长eGFP的表达时间,比对照组BV-WK(-)-eGFP延长了72 h。经VSV-GED假型化的杆状病毒BV-WK-eGFP、BV-WK-ITR-eGFP转导OL细胞的时间明显缩短,比阴性对照BV-WK(-)-eGFP减少了24 h,并且转导效率分别高出阴性对照25.7%与36.5%。【结论】实验证明了VSV-GED能够有效提高杆状病毒的转导效率,WPRE能够显著增强外源基因的表达效率,ITRs延长外源基因的表达时间。为探究改进型重组杆状病毒在脊椎动物细胞表达外源基因及新型重组活载体疫苗的研发奠定了基础。